¡Atención a los científicos que desarrollan métodos! Conozca las nuevas herramientas para replicar sus métodos existentes

Aspectos destacados del seminario web | Simplificación de la transferencia de métodos: Nuevas herramientas para replicar sus métodos establecidos en un sistema ACQUITY Arc

Soy la Dra. Paula Hong, científica principal de Waters Corporation. Recientemente dirigí un seminario web en el que se hablaba de las características de los instrumentos que pueden afectar a la transferencia de los métodos de fase inversa establecidos en los sistemas de HPLC y UHPLC. Estos factores incluyen el volumen de permanencia, la dispersión fuera de la columna y el precalentamiento de la fase móvil o el control de la temperatura. También discutimos las formas de evaluar su instrumento y algunas herramientas novedosas para ayudar a transferir los métodos de HPLC establecidos de las generaciones anteriores de equipos de LC a los sistemas modernos de UHPLC.

Si se lo perdió, ver el seminario web a la carta.

Tuvimos muchas y muy buenas preguntas. Estos son algunos de los aspectos más destacados de nuestras preguntas y respuestas:

1. ¿Alguna sugerencia cuando se utilizan columnas HPLC (300 x 7,8 mm) en un sistema de baja dispersión como el sistema UPLC H-Class?

Para los sistemas de baja dispersión en general, las columnas de HPLC pueden requerir tubos de mayor diámetro desde el inyector a la columna y desde la columna al detector para reducir la contrapresión y aliviar cualquier efecto fuerte del disolvente. En concreto, el sistema ACQUITY UPLC H-Class puede acomodar columnas más grandes con un compartimento de columna de 30 cm. Este compartimento de columna está disponible en varias configuraciones, con precalentamiento activo o pasivo. Para las columnas de HPLC y los caudales más altos, la configuración con precalentamiento pasivo puede ser más adecuada, ya que tiene tubos de diámetro interior más grandes. Esto ayudaría a reducir los fuertes efectos del disolvente y a reducir la contrapresión.

2. ¿Recomienda el intercambio de disolventes cuando se encuentra en un disolvente fuerte?

Sí, - como se ha comentado anteriormente, cuando se observan fuertes efectos del disolvente, una solución es ajustar el diluyente de la muestra a las condiciones iniciales de la fase móvil. Sin embargo, también se puede añadir volumen entre el inyector y la columna para mejorar la mezcla y reducir los efectos fuertes del disolvente. Esto puede incluir la adición de un trozo de tubo o un filtro de columna. Además, el escalado de su método, y con él el volumen de inyección, a una configuración de columna más pequeña también reduce los efectos fuertes del disolvente.

3. ¿Podría comentar el efecto del calentamiento de la precolumna sobre la resolución y la eficacia de estas diferentes variantes de columna/sistema?

El precalentamiento del disolvente es importante para garantizar un control adecuado de la temperatura. Un mal control de la temperatura puede dar lugar a efectos de desajuste térmico o a la pérdida de eficacia de una separación. Sin embargo, el precalentamiento puede verse afectado por el caudal debido al tiempo de residencia en el precalentador. Muchos instrumentos tienen precalentamiento activo y/o pasivo. Siempre que el control de la temperatura de la fase móvil sea adecuado, ambos pueden proporcionar un rendimiento cromatográfico similar.

4. Usted ha mencionado la reducción del volumen de la celda de flujo. ¿Esto reduce la intensidad de la señal?

No, no en sí mismo. En realidad, si se redujera el volumen de la celda de flujo y se mantuviera constante todo lo demás, la dispersión de la extracolumna sería menor. Esto daría lugar a una menor anchura de los picos y a una mayor altura de los mismos para aumentar la sensibilidad. Sin embargo, hay otros factores. Sabemos que la absorbancia UV se basa en la ley de Beer, que se deriva del coeficiente de extinción molar, la longitud del trayecto y la concentración. Una célula de flujo de menor volumen puede tener también una longitud de trayecto diferente. Ambas contribuirán a la absorbancia. Por ejemplo, hemos comprobado que el cambio de una celda de flujo analítica con un recorrido de 10 mm a una celda de flujo microperforada con un recorrido de 8 mm no cambió la sensibilidad. Si bien la celda de flujo de menor dispersión produjo picos más nítidos y una mayor resolución, la menor longitud del trayecto anuló cualquier aumento de la sensibilidad.

5. ¿Debo poner una retención isocrática en mi método?

Como nunca sabemos si vamos a transferir a un sistema con un volumen de permanencia mayor o menor, tiene sentido añadir una retención isocrática en nuestro método. Cuando lo hagamos, simplemente podemos cambiar la duración de esa retención para ajustar las diferencias de volumen de permanencia entre los sistemas.

6. ¿Es necesario medir el volumen de permanencia de mi sistema?

Bueno, eso depende. La mayoría de los fabricantes indican los valores de volumen de permanencia en las especificaciones del instrumento. Esto le da un buen punto de partida. Incluso si no tiene un valor general, puede probar su método y luego hacer pequeños (o grandes) ajustes en el método basándose en los tiempos de retención. Si sigue teniendo problemas, la medición del volumen de retención puede ayudarle a comprender el rendimiento de su sistema.

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También puede obtener más información sobre las aguas Cartera de LC y el nuevo Sistema ACQUITY Arc en el sitio web de Waters.