Elección de la columna correcta para la selectividad cromatográfica

A la hora de desarrollar un método para el análisis rutinario de multirresiduos de plaguicidas en productos alimentarios, hay varios factores que deben tenerse en cuenta a la hora de seleccionar la columna de cromatografía líquida (CL) que se va a utilizar. Entre los requisitos se encuentran:

• Buena retención para una serie de propiedades fisicoquímicas (polares, no polares, bases, ácidos).
• Resolución moderada a alta (capacidad máxima).
• Los extractos de las muestras pueden ser crudos, por lo que la columna necesita estabilidad mecánica.
• Buena forma de pico para una amplia gama de analitos.
• Capacidad de transferir la separación a múltiples instrumentos dentro del laboratorio y a otros laboratorios.

En un blog anterior, describimos la importancia de la retención, cómo calcularla y asegurar que sus métodos tienen la suficiente para cumplir las directrices y dar resultados fiables. En este blog voy a considerar algunos parámetros de la fase estacionaria de la columna y de la fase móvil que pueden afectar a la selectividad de los métodos de cromatografía.

Cuando se consideran los diversos factores de una columna de cromatografía líquida que pueden afectar a la selectividad del método, éstos pueden describirse como los factores químicos que se muestran a continuación:

¿Qué es la selectividad?

La selectividad (α), es la capacidad de un método para distinguir entre dos o más analitos, puede verse afectada por la elección de la fase estacionaria y los disolventes y aditivos de la fase móvil.

Un ejemplo de que la selectividad puede ser importante es cuando tenemos compuestos que son isómeros estructurales como la sebutilazina y la terbutilazina. Si no se logra la separación de estos dos compuestos mediante nuestro método de cromatografía líquida, el método de adquisición por espectrometría de masas no podrá distinguir entre los dos compuestos si coeluyen.

Para calcular la selectividad, necesitamos saber un par de cosas, inicialmente necesitamos el t0 que explicamos cómo calcular en el blog anterior. También necesitamos los tiempos de retención (tR1 y tR2) de nuestros dos compuestos de interés. Una vez recopilada esta información, podemos utilizar la siguiente ecuación para calcular el factor de retención (k) de cada uno de nuestros picos de interés:

k = (tR - t0)/ t0

Cálculo del factor de retención (k)

Una vez que tenemos nuestros valores K1 y K2 podemos calcular la selectividad (α) entre nuestros dos picos utilizando la siguiente ecuación que da una relación de los dos factores de retención:

α = k2/k1

Cálculo de la selectividad (α), relación del factor de retención (K) entre dos picos

Si tomamos la sebutilazina y la terbutilazina y calculamos el α basándonos en la separación que se muestra a continuación, obtendremos un resultado de 1,02, el valor aumentará si se mejora la separación entre los dos picos o disminuirá si los picos eluyen más cerca el uno del otro.

¿Factores que afectan a la selectividad?

Al hacer cambios en la fase estacionaria o en la fase móvil, cambiamos la forma en que nuestros analitos interactuarán entre estas dos fases. Si nuestros compuestos de interés interactúan con estas dos fases de forma diferente, podremos separarlos, y cuanto mayor sea la diferencia, mayor será la separación. Esto se mide como el factor de retención (k) y podemos medir los efectos de los cambios en la selectividad entre los analitos utilizando el factor de selectividad (α). En este blog nos centraremos en el impacto que el cambio de fase estacionaria puede tener en la selectividad, así como en el papel de los disolventes orgánicos. En un futuro blog trataremos cómo afecta a la selectividad el uso de aditivos y tampones en la fase móvil.

The use of C₁₈ columns is common practice for the retention and separation of different pesticide classes in multiresidue methods. There are many different types of C₁₈ columns and there will be retention and selectivity differences between them, depending on the ligand and base particles used. In the example below four different <2 µm Waters C₁₈ stationary phases with the same dimensions (2.1 x 100 mm), have been tested using the same system and mobile phase to monitor the separation of sebuthylazine and terbuthylazine. These four C₁₈ columns have a range of different characteristics which give them unique selectivity’s. The CORTECS C₁₈ is a solid core 1.6 µm particle, providing high efficiency separations. The other three columns are fully porous particles, they include an ethylene bridged hybrid (BEH) C₁₈, a charged surface hybrid (CSH) C₁₈ and finally a high strength silica (HSS) T3 column. The HSS T3 column is a C₁₈ stationary phase technology with proprietary end-capping, optimised pore size and ligand density to achieve optimum characteristics suited for polar compound retention under reversed phase conditions.

La elección del disolvente orgánico en la cromatografía líquida de fase inversa puede producir resultados diferentes al analizar compuestos en la misma columna. Los disolventes más comunes, como el metanol y el acetonitrilo, producen resultados diferentes y deben tenerse en cuenta las propiedades de estos disolventes a la hora de desarrollar un método. El metanol es un disolvente prótico, debido al grupo hidroxilo (-OH), mientras que el acetonitrilo es el más fuerte de los dos disolventes en términos de elución en fase inversa, también es un disolvente aprótico ya que no tiene un átomo de hidrógeno unido a un oxígeno o a un nitrógeno.

En el caso de nuestros dos isómeros, el uso de acetonitrilo en lugar de metanol ha afectado a nuestra separación de dos maneras. Inicialmente, como era de esperar, los picos han eluido más rápido, lo que no es sorprendente y se esperaba porque el acetonitrilo es el disolvente de elución más fuerte. Sin embargo, en este caso el acetonitrilo también ha proporcionado una mejor selectividad entre los dos compuestos que la observada con el metanol.

Conclusión

Las diferentes fases estacionarias de las columnas y los disolventes orgánicos son factores químicos que pueden afectar a la selectividad y a la resolución cromatográfica. Incluso diferentes columnas clasificadas como C18 pueden tener diferentes características de retención y selectividad en función de la partícula base y los ligandos utilizados. En el análisis de plaguicidas multirresiduos cabe esperar que se produzcan algunos compromisos en el rendimiento cromatográfico para analizar una amplia gama de compuestos con diferentes propiedades fisicoquímicas. Mediante pruebas iniciales de la fase estacionaria de la columna y del disolvente orgánico, pueden evaluarse factores como la retención, las separaciones clave y las formas de los picos para garantizar que se consigue el máximo rendimiento cromatográfico, lo que repercute positivamente en la calidad de los datos.

Fuentes de información:

1. Appendix: HPLC Nomenclature, Waters Corporation
2. The Promise of Small Particles, Waters Corporation