La integridad de los datos es importante: Limitar el acceso a las herramientas que podrían utilizarse para manipular los datos (Parte 4)

Supresión de la integración de picos

Poder optimizar la integración e identificación de los picos, ya sea reajustando la configuración de la RT del método, identificando manualmente los picos o suprimiendo la integración de picos específicos conocidos, son ciertamente herramientas que, en manos equivocadas, con la intención equivocada y sin un proceso de formación y revisión sólido, pueden ser utilizadas por personal sin escrúpulos para manipular fraudulentamente un resultado fallido en una especificación de aprobación.

Anteriormente hemos introducido estos cuatro escenarios de preocupación

1. Inyecciones de preparación del sistema/prueba/equilibrio
2. Múltiples intentos de optimizar los parámetros de integración para lograr una integración precisa
3. El uso de la integración manual para lograr una integración precisa
4. Supresión de la integración de picos para evitar que ciertos picos se incluyan en los análisis

En este blog analizaremos el cuarto escenario y la necesidad legítima de excluir los picos de los cálculos, cómo se ha utilizado tradicionalmente la inhibición de la integración u otras herramientas de integración para ello y por qué a los reguladores les preocupa que la supresión de la integración de los picos se esté utilizando de forma incontrolada para ocultar los picos no deseados.

Se pueden utilizar herramientas útiles para obtener resultados precisos y coherentes, pero también, en las manos equivocadas o si alguien tiene la intención, podrían utilizarse para falsificar datos. ¿Cómo se puede distinguir la diferencia?

Como se ha comentado anteriormente, los cromatogramas obtenidos experimentalmente, procedentes de detectores que monitorizan compuestos específicos disueltos en una fase móvil, que pasan sobre una fase estacionaria tratada químicamente, no se comportan tristemente de forma perfecta con ninguna teoría química o física. Además de la forma imperfecta de los picos no gaussianos, las consideraciones ambientales y de flujo de la fase móvil afectarán sin duda a la línea de base idealmente suave. Por ejemplo, es bien sabido que la introducción de la muestra, conocida como inyección, provocará, en casi todos los casos, una perturbación de la línea de base distinta que los científicos utilizan para indicar el volumen vacío de la columna (o Vo). Además, especialmente en la cromatografía de gradiente, el cambio químico gradual de la fase móvil efectiva mediante la introducción de una segunda fase móvil, suele crear una pendiente en la línea de base, que luego volverá al punto de partida inicial cuando el análisis vuelva a las condiciones iniciales. Estas condiciones de gradiente también pueden utilizarse para "lavar" la columna y eliminar los compuestos fuertemente retenidos que no forman parte realmente de la muestra analizada. Estos compuestos no pertenecientes a la muestra pueden proceder de la fase móvil, del diluyente de la inyección o de parte del proceso de preparación de la muestra.

Quizá pueda adivinar que las perturbaciones de la línea de base descritas anteriormente suelen encontrarse en las primeras o últimas porciones de un cromatograma. Este tipo de perturbaciones o picos de la línea de base también se verán en las inyecciones en blanco, que son fundamentales para ejecutar como parte de la validación del método, pero a menudo también durante los análisis de muestras. Dado que los parámetros de integración de la línea de base pueden verlos como verdaderos picos cromatográficos de la muestra, es una práctica muy común instruir al software cromatográfico para que retrase el inicio de la integración de los picos o la finalice antes de tiempo, para evitar la integración de lo que se conoce como "picos del sistema", ya que no son representativos de la composición de la muestra. En muchos casos, cuando un paso de lavado de la columna crea un ruido extremo en la línea de base, la adquisición de datos puede detenerse una vez que todos los componentes verdaderos hayan eluido.

También pueden producirse otros tipos de picos "no de muestra" en zonas distintas al principio y al final de un cromatograma. Los picos causados por aditivos en el diluyente de la inyección, por ejemplo, pueden eluir entre los picos genuinos de la muestra. Por supuesto, éstos también serían visibles en las inyecciones en blanco.

La figura 1 muestra una inyección en blanco (escalada automáticamente para llenar la pantalla) que muestra todos los efectos del sistema en el cromatograma

La figura 2 muestra cómo una inyección estándar (azul) superpuesta con el blanco (negro), tiene picos verdaderos del estándar pero también incluye los picos del sistema y la perturbación de la línea base del gradiente que son visibles en el blanco

Evidentemente, estos picos que no son de la muestra no deben incluirse en los resultados del análisis de la muestra. Pero su exclusión debe explicarse claramente en el método y justificarse científicamente. La exclusión correcta de los picos del sistema o del diluyente debe formar parte de la revisión de la segunda persona, como control de calidad para asegurarse de que no se han pasado por alto picos genuinos de la muestra (o nuevas impurezas de la muestra).

¿Cómo se excluyen estos efectos del sistema de la evaluación cromatográfica? Lo normal es evitar que estos picos se integren. Esto es necesario, especialmente cuando alguna de las evaluaciones de la muestra utiliza valores como Área% o Cantidad%, en los que estos picos adicionales perturbarían el resultado final si se incluyeran en los totales. También es una práctica habitual excluir los picos muy pequeños de este tipo de cálculos, como los que, en la primera integración, son inferiores al 0,5% del área total.

El parámetro más típico del método de integración utilizado se ha mencionado anteriormente, se conoce casi universalmente como Integración Inhibida. Todos los sistemas CDS disponen de una función de este tipo que retrasa el inicio de la evaluación de los picos al comienzo del cromatograma o detiene la detección de los picos en un momento determinado una vez que los picos críticos han eluido. La colocación de estos eventos es fundamental para evitar la supresión de la integración de un componente real de la muestra. Dado que los efectos de las líneas de base se producirán en todas las pruebas inyectadas, esta integración de inhibición se utilizará tanto en las inyecciones de estándares como en las de muestras. Sin embargo, también es importante incluir inyecciones en blanco para justificar la colocación de eventos de Inhibición de Integración.

Pero hay otros eventos de integración que pueden utilizarse para suprimir la detección de picos. Estos incluyen, pero no se limitan a, establecer un Área mínima temporizada o Alturas mínimas o simplemente establecer un valor de umbral alto o de ancho de pico en puntos específicos del cromatograma. Cada uno de estos eventos puede ser necesario legítimamente para la integración adecuada de los picos o para suprimir la fluctuación de la línea de base conocida como ruido, sin embargo, podría ser igualmente utilizado para excluir cualquier pico elegido.

Por esta razón, ha habido observaciones reglamentarias que sugieren que los eventos de integración de picos, en particular los que suprimen la integración de picos, podrían utilizarse de forma fraudulenta para manipular los datos cromatográficos. En 2017, se emitió una carta de advertencia con una observación de que el software estaba "configurado para permitir un uso extensivo de la función "inhibir la integración" sin justificación científica. " La carta continuaba describiendo cómo en algunas pruebas de impurezas se utilizaba la función "se configuró para inhibir la integración de los picos en cuatro periodos de tiempo diferentes". Por supuesto, no es posible saber si el uso aquí estaba justificado o no, pero en los métodos más antiguos basados en UV, esto puede haber sido simplemente utilizado para eliminar los picos del sistema o del diluyente, como los que aparecen en mi inyección en blanco de ftalato arriba en alrededor de 2,4 minutos.

Aunque en esta carta de advertencia se señalaban específicamente los eventos de integración de inhibición, la simple prohibición o restricción del acceso a este único evento no resuelve el problema subyacente, ya que otros parámetros de integración legítimos podrían utilizarse igualmente para ocultar los picos de la evaluación.

Existen otras soluciones para tratar los picos del sistema que aparecen en los blancos. Si la cromatografía, con sus particularidades, tiene tiempos de retención y respuestas de pico estables, podría utilizarse la sustracción de la línea de base para eliminar los picos del sistema. En mi ejemplo, esto podría ser adecuado para eliminar los picos a los 2,4 minutos, pero menos útil para eliminar los picos anteriores a 1 minuto que no se superponen directamente. En muchos casos, las complicaciones como los picos del sistema se abordan obviando los cálculos de CDS y realizando toda la calibración y cuantificación mediante aplicaciones externas como LIMS o incluso hojas de cálculo de Excel. En este caso, es muy fácil elegir los picos que se incluyen en los cálculos y los que se ignoran, con poca trazabilidad.

En un LC-GC webcastNeil Lander y yo mostramos cómo las nuevas funciones de Empower pueden designar picos en blanco, de diluyente o del sistema. Los analistas pueden entonces permitir que se integren y se informen, pero configurar cálculos específicos en la funcionalidad de análisis de impurezas para incluir o excluir estos picos designados. Esto se configuraría y probaría durante la validación del método para demostrar que los métodos de Empower se utilizan adecuadamente. También puede ver este consejo del blog Empower Tip of the Week sobre este tema del análisis de impurezas. (Consejo #41)

En la próxima entrada del blog, hablaré de cómo esta intervención específica de los analistas en el establecimiento de los parámetros de procesamiento podría ser un factor en las recientes preocupaciones sobre las impurezas de nitrosamina (NDMA, NDEA) en los medicamentos para el corazón conocidos oficialmente como ARB y extraoficialmente como 'sartanes, así como los medicamentos comunes antiácidos de venta libre que contienen ranitidina.