Maximizar la vida útil de la columna de LC: 3 consejos para reducir el deterioro químico

Kevin Jenkins

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Todas las columnas cromatográficas tienen una vida útil finita que depende en gran medida de su cuidado y uso. Incluso en las mejores condiciones, las columnas de HPLC y UPLC se deterioran con el tiempo debido a la contaminación química o de partículas.

Muchas de las limitaciones en la vida útil de la columna no se deben a la columna, sino que están causadas por otros factores que pueden atribuirse al deterioro químico o a la contaminación física. Algunos de estos factores son inevitables y forman parte del uso normal.

Para conseguir la máxima vida útil y el máximo rendimiento de su columna de LC analítica se pueden seguir 3 sencillas recomendaciones para reducir el deterioro químico.

1. Conozca las condiciones de funcionamiento de su columna

Sé que esto parece obvio, pero si se siguen las directrices del fabricante en cuanto a los rangos operativos de la temperatura de la columna, el pH de la fase móvil y los aditivos de los tampones, se mejorará en gran medida la vida útil y el rendimiento de la columna.

Los fabricantes de columnas prueban exhaustivamente las columnas en una amplia gama de condiciones de funcionamiento para garantizar su solidez y buen rendimiento. Afortunadamente, esta información se incluye en los manuales de cuidado y uso de la mayoría de las columnas. Preste especial atención a la sección "Uso de la columna" del manual de la columna, que suele incluir recomendaciones para la preparación de muestras, directrices sobre el rango de pH, información sobre los disolventes y consejos sobre la presión máxima de funcionamiento.

Por ejemplo, las empaquetaduras de fase inversa a base de sílice son muy estables a temperatura ambiente para la mayoría de las condiciones de la fase móvil entre pH 2 y 8; las partículas de sílice híbrida amplían el rango de pH operativo de 1 a 12. Sin embargo, si se aumenta la temperatura, especialmente cuando se trabaja cerca de los límites de pH del material del empaque, la vida de la columna puede deteriorarse rápidamente. Esto plantea problemas, especialmente para muchos métodos USP que operan cerca o cerca del pH 7. Si se combinan estas condiciones con temperaturas elevadas de la columna, lo más probable es que se produzca un fallo temprano de la columna debido a la disolución de la partícula de sílice.

Esto suele crear un vacío en la fase estacionaria a la entrada de la columna, lo que provoca una distorsión en la forma de los picos y, en casos extremos, picos divididos.    

En condiciones de pH más bajo de la fase móvil, el ligando puede potencialmente hidrolizarse y escindirse de la superficie de la fase estacionaria, lo que resulta en un aumento de la cola de los picos y una reducción de la retención del analito.

La elección de los iones tampón utilizados en la fase móvil desempeña un papel importante en la degradación de la columna. Los tampones de fosfato se utilizan habitualmente, pero no son la mejor opción; se pueden obtener resultados significativamente mejores con tampones de base orgánica como TRIS o citrato. En general, los tampones de base orgánica son menos agresivos con la superficie de sílice. La concentración del tampón contribuye a la vida útil de la columna: las concentraciones más bajas de tampón mejoran la vida útil de la columna.

En algunos casos, es inevitable operar en los extremos. Las condiciones de separación deben equilibrarse con la robustez del ensayo; sin embargo, incluso en condiciones más estresantes, se puede conseguir una buena vida útil de la columna si se siguen las directrices de fabricación.

2. Garantizar el equilibrio y el acondicionamiento adecuados de la columna

El equilibrio de la columna es sencillo y el tiempo de equilibrio depende de la composición y la concentración de la fase móvil. En general, las condiciones de fase móvil más concentradas requieren menos tiempo de equilibrado en comparación con las composiciones más diluidas. Esto se debe a la cinética entre la fase móvil y la fase estacionaria, ya que las fases móviles más diluidas imparten una menor concentración superficial en la fase estacionaria.

El factor clave para el equilibrio de la columna es el volumen de la fase móvil, no el tiempo. Normalmente, se recomienda utilizar de 5 a 10 volúmenes de columna vacíos para un correcto equilibrio de la columna.

Hay diferencias entre el equilibrio de la columna y el acondicionamiento de la columna - estos dos términos no deben ser confundidos.

El equilibrio de la columna comprende todos los fenómenos que son reversibles, mientras que el acondicionamiento de la columna cambia la columna de forma irreversible. El acondicionamiento de la columna puede afectar significativamente a su vida útil. Cuando usted acondiciona una columna, está cambiando el producto que el fabricante le ha entregado, y la reproducibilidad de este paso es su responsabilidad.

Generalmente se desaconseja el acondicionamiento, pero hay algunas circunstancias en las que es inevitable. Por ejemplo, muchas separaciones por emparejamiento iónico requieren un equilibrio y un acondicionamiento significativos de la columna antes de obtener tiempos de retención estables. En este caso, los aditivos interactúan con la superficie de la fase estacionaria para impartir el efecto químico deseado. Por esta razón, las columnas que han sido acondicionadas de esta manera deben dedicarse a ese ensayo y condiciones de separación específicos.

Una vez acondicionada, la columna raramente funcionará de forma fiable para separaciones de propósito general y debería evitarse para desarrollar nuevos métodos.

3. Almacenamiento adecuado de la columna

 

Hay muchas maneras diferentes de almacenar una columna de HPLC que tienen poco efecto en la longevidad de la columna. La elección de las condiciones de almacenamiento es bastante amplia y puede basarse en la comodidad.

La forma más conveniente de almacenar la columna es en la fase móvil en la que se utiliza habitualmente. La mayor ventaja de este enfoque es que el equilibrio de la columna con la fase móvil es muy rápido. Este enfoque se recomienda especialmente para la cromatografía en fase normal, donde los cambios en el disolvente de almacenamiento pueden dar lugar a un largo equilibrio.

Hay que pensar bien en este enfoque. Las condiciones ideales para almacenar una columna de cromatografía dependen del tipo de fase estacionaria. Las columnas de fase estacionaria suelen cambiar lentamente cuando se almacenan utilizando fases móviles y aditivos comunes. Por lo tanto, la conveniencia de almacenar la columna en la fase móvil debe equilibrarse con la reducción de la vida útil de la columna. Las columnas C18 y C8 de uso común son lo suficientemente estables como para ser utilizadas durante varios meses con pocos cambios en su hidrofobicidad. Sin embargo, las fases enlazadas basadas en cadenas más cortas pueden hidrolizarse de forma apreciable en pocas semanas.

Las mejores condiciones de almacenamiento de las columnas de fase inversa dependen de la frecuencia de su uso. Si la columna se utiliza a diario, o incluso cada pocos días, lo más conveniente es dejarla en la fase móvil utilizada para la separación. Para el almacenamiento a largo plazo, muchos fabricantes de columnas recomiendan lavar la columna de sales tampón.

Relacionado con el almacenamiento está el "lavado" de la columna o el uso de un disolvente de lavado que se supone que disuelve los contaminantes adsorbidos -más allá de eliminar los tampones de la fase móvil- para prolongar la vida útil de la columna. En muchos casos, este proceso más agresivo simplemente no funciona. Por ejemplo, si los contaminantes son proteínas que se han precipitado en la columna, cuando se intenta lavarlas ya han envejecido por desnaturalización o por reticulación que hace imposible su solubilización.

Más relacionado con el almacenamiento de la columna, cada lavado o cambio de disolvente también elimina la fase ligada hidrolizada, que de otro modo permanece en un equilibrio local en el lugar donde se produjo la hidrólisis. Los lavados frecuentes e innecesarios pueden provocar un envejecimiento acelerado de la columna al eliminar el ligando enlazado.

Los consejos presentados anteriormente abordan interacciones químicas comunes que a menudo se pasan por alto pero que siguen siendo importantes para maximizar la vida útil de la columna.

 

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