Control de múltiples atributos: El creciente papel de la espectrometría de masas en el análisis de subunidades de mAb

Los laboratorios biofarmacéuticos descubren que el análisis de subunidades puede lograr un mayor rendimiento en ensayos robustos de monitorización multiatributo

La tecnología de espectrometría de masas ha sido crucial y se ha aplicado ampliamente en el análisis de fármacos bioterapéuticos, ya que puede detectar y medir una amplia variedad de atributos de calidad del producto y del proceso con gran selectividad y sensibilidad, como clips, glicosilación, glicación, oxidación, desamidación, variantes de secuencia, etc.

Los ensayos de monitorización multiatributo (MAM) basados en tecnologías LC-MS han ganado popularidad en los últimos años, ya que permiten a los investigadores detectar y medir múltiples atributos de calidad de forma simultánea, permitiendo flujos de trabajo analíticos más racionalizados y productivos.

En la actualidad se están aplicando dos enfoques de MAM para el análisis bioterapéutico:

• Análisis de la masa de la subunidad de anticuerpos monoclonales (mAb)
• Análisis de péptidos a partir de una digestión de proteínas (flujo de trabajo de mapeo de péptidos)

Ambos tienen sus ventajas y desventajas. La elección de qué enfoque adoptar depende realmente de la molécula y de los atributos que deban analizarse, así como de los objetivos de la organización de desarrollo y fabricación.

En general, los flujos de trabajo de MAM basados en péptidos ofrecen una mayor sensibilidad y se están evaluando cada vez más, pero los análisis basados en subunidades de mAb son más rápidos y fáciles de ejecutar. Se han utilizado durante años para apoyar el desarrollo de productos y procesos, y también en ensayos de liberación de control de calidad validados.^{1, 2}

En un reciente artículo de revisión, los científicos de Roche describen una prueba QTof ESI-MS de subunidad reducida para evaluar la variación de la glicosilación de Trastuzumb que implementaron por primera vez en 2004, y en la que se obtuvieron datos de más de 500 lotes de medicamentos con sólo tres desviaciones de idoneidad del sistema desde su inicio.

Análisis de masas de subunidades: De la caracterización al seguimiento de atributos y al control de calidad

La preparación de la muestra para el análisis de la masa de las subunidades de los mAb comienza con una digestión enzimática (normalmente con pepsina o Ides) y/o reducción del mAb terapéutico, lo que genera tres fragmentos de subunidades primarias (LC, Fd', scFc) que pueden separarse rápidamente y analizarse mediante LC-MS. Los resultados de la EM deconvolucionada pueden utilizarse para proporcionar una medición semicuantitativa de diferentes atributos de calidad, como la glicosilación, la oxidación, la variante de la secuencia de clipsand, etc.

Dada la relativa sencillez y robustez de la preparación de las muestras y la rapidez del análisis LC-MS, el análisis de subunidades se ha convertido en un método de elección no sólo para la caracterización, sino también para el seguimiento de atributos de mayor rendimiento para apoyar el desarrollo y la fabricación de productos/procesos.

Los científicos de Eli Lilly utilizaron un enfoque rápido de LC-MS de subunidades3 para caracterizar primero los patrones de glicosilación ligados al N en el dominio Fab (unión de fragmentos de antígenos), independientemente de la glicosilación canónica que se encuentra en el dominio Fc.³ Utilizando este método semicuantitativo, demostraron el impacto de la glicosilación Fab y Fc en el aclaramiento, e identificaron los oligosacáridos Fab que contienen GlcNAc terminal y M6P como atributos de calidad críticos (CQAs) que deben ser controlados adecuadamente.

El enfoque de Eli Lilly proporcionó datos de perfiles de glicosilación rápidos y precisos durante el desarrollo del producto y se utilizó para desarrollar una estrategia de control integrada para garantizar la calidad del producto. En una presentación posterior en un taller de la USP de 2015 sobre análisis de glicosilación para productos biofarmacéuticos, describieron el desarrollo de este ensayo y detallaron su validación ICH de este enfoque como ensayo de liberación de candidatos para su bioterapéutico.

Implementación del análisis de subunidades de alto rendimiento para el MAM en proceso

Con un flujo de trabajo racionalizado disponible ahora bajo la informática preparada para el cumplimiento de las GMP para automatizar la adquisición, el procesamiento y el informe de los datos de LC-MS^{,4, 5} los análisis de subunidades de mAb pueden implementarse fácilmente en entornos de laboratorio regulados y no regulados, apoyando la caracterización de productos, la supervisión de atributos para el desarrollo y la optimización de productos y procesos, e incluso la liberación de QC.

Científicos de Janssen compartieron recientemente su éxito en el desarrollo de un método de monitorización de atributos múltiples altamente sensible y reproducible6 con la purificación de proteínas de alto rendimiento seguida de un rápido análisis de masa de subunidades. Utilizando este método de plataforma, se cuantificaron simultáneamente múltiples atributos del producto, incluyendo la aglicosilación, la glicosilación y la glicación, en una serie de estudios DOE (Diseño de Experimento) a pequeña escala, y se establecieron eficazmente las correlaciones entre los niveles de estos atributos de calidad y determinados parámetros del proceso de cultivo celular.

Los autores de Janssen declararon: "Este método amplía significativamente la capacidad del análisis LC-MS para la monitorización en proceso".

Los científicos de Janssen destacaron el potencial del método MAM como "una eficiente estrategia de control de retroalimentación en tiempo real que puede mejorar significativamente la solidez de la producción, la rentabilidad de la fabricación y la calidad del producto en el desarrollo biofarmacéutico".

En un segundo estudio publicado por los científicos de Janssen, éstos destacó la ventaja de aplicar un método MAM basado en subunidades⁷ para evaluar los perfiles de oxidación. Utilizando un sistema UPLC-MS de Waters, específicamente el Solución de plataforma biofarmacéutica con UNIFIAdemás, demostraron la reproducibilidad y la precisión intermedia del método y calificaron y validaron el sistema para su uso en un entorno GMP, mostrando la aplicabilidad de esta plataforma en entornos de desarrollo y control de calidad en fase avanzada.

El MAM basado en la subunidad tiene muchas ventajas, pero está limitado en su capacidad para controlar los pequeños cambios de masa que acompañan a las modificaciones, como la desamidación y la isomerización, y no es capaz de generar información específica del sitio cuando se localizan múltiples modificaciones en el mismo fragmento de la subunidad.

Para estas situaciones, los análisis basados en péptidos se consideran flujos de trabajo complementarios.

El próximo post de mi serie tratará sobre el MAM basado en el mapeo de péptidos.

Lea la primera parte de la serie: De la caracterización al desarrollo tardío, la fabricación y el control de calidad: El creciente papel de la espectrometría de masas en la bioterapia

Referencias:

1. Firth et. al. Evaluación ortogonal de la glicosilación bioterapéutica: Un estudio de caso que correlaciona la afucosilación del núcleo del N-Glycan de Herceptin con el mecanismo de acción Anal Chem. 2016, 88, 10259-10265
2. Haberger et. al. Application of Electrospray Ionization Mass Spectrometry in a Quality Control Laboratory. Am Pharm Review. 2016, 19(5)
3. Huang et al. Impact of variable domain glycosylation on antibody clearance: an LC/MS characterization. Anal Biochem. 2006, 349 (2): 197-207
4. Henry Shion et al. Biopharmaceutical Platform Solution with UNIFI: Streamlining Compliant and Non-Compliant Intact Mass Analysis of Biotherapeutic mAbs
5. Ranbaduge et. al. Automated Protein Modification Characterization of the Intact and Subunit NIST Monoclonal Antibody Reference Standard with Waters UNIFI Scientific Information System
6. Dong et al. High-Throughput, Automated Protein A Purification Platform with Multiattribute LC-MS Analysis for Advanced Cell Culture Process Monitoring. Chem. 2016, 88, 8673-8679
7. Sokolowska et al. Análisis de masas de subunidades para el seguimiento de la oxidación de anticuerpos. mAbs, 2017, 0, 1-8