Aspectos destacados del seminario web: La cuantificación de cannabinoides en el fluido oral para determinar el deterioro de la conducción tras el consumo de marihuana

Preguntas y respuestas del seminario web sobre el uso de un sistema ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQ-S micro MS para cuantificar cannabinoides en fluidos orales

El equipo forense de Waters patrocinó recientemente un seminario web sobre las ventajas de utilizar el análisis cuantitativo de fluidos orales para la toxicología forense y la discapacidad en la conducción. El seminario web fue impartido por el Dr. Philip Sobolesky, becario de química clínica de la Universidad de California.

A continuación, un resumen de las preguntas formuladas al final del seminario web, la mayoría de las cuales no se respondieron en directo porque el tiempo no lo permitía.

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¿La eficacia de la extracción que presentó es para la placa HLB o para el dispositivo Quantisal? ¿Se extraen también los calibradores y los controles como muestras de pacientes en el dispositivo Quantisal antes de la SPE? ¿Ha realizado evaluaciones de estabilidad a corto o largo plazo para sus calibradores?

La eficiencia de extracción que presenté era para la placa HLB. Hice algunos pequeños experimentos examinando el % de recuperación de los analitos del dispositivo quantisal y mis resultados (~30% de pérdida estrictamente debida al dispositivo) coincidían con los de los valores publicados anteriormente (M. Fabritius, C. Staub, P. Mangin, C. Giroud, Analysis of cannabinoids in oral fluid by liquid chromatography-tandem mass spectrometry, in: Forensic Toxicol., 2013: pp. 151-163. doi:10.1007/s11419-012-0168-z.).

Hasta ahora hemos demostrado que no hay un efecto significativo (>20% de cambio) en Cals y QC's después de 10 ciclos de descongelación del congelador. Los estudios de estabilidad a largo plazo siguen en curso con una estabilidad validada de 1 año para los calibradores y los QC.

Diferentes cepas de marihuana contienen diferentes perfiles de cannabinoides. ¿Cómo evitará esta prueba el sesgo de las altas concentraciones de, digamos, CBN, (una molécula que resulta de la degradación de los cannabinoides a través del calor y la luz del tiempo)? Si se utilizara el CBN como indicador, se podría argumentar que no es un medio preciso para determinar el deterioro en función del tiempo.

Se podría argumentar que el CBN no era un buen indicador debido a la alta degradación, pero todavía no hemos visto ningún paciente que tenga un nivel de CBN superior a la concentración de THC correspondiente. Por lo tanto, cuando nuestros datos estén finalizados, lo más probable es que (>x) la concentración de THC se asocie con el deterioro y pueda confirmarse además por la presencia de (y) la concentración de CBN.

Además, ¿se alteraron los resultados al introducir la ingesta de alimentos? (Usted mencionó que hubo una pausa para comer.) ¿Causa un nivel alto de glucosa en sangre algún problema de exactitud y precisión?

Hasta ahora no hemos detectado ningún resultado anormal después de la comida que pudiera indicar una interferencia dietética, sin embargo tampoco estamos midiendo la glucosa en sangre en ningún momento. Por lo tanto, es difícil responder a su pregunta, ya que no se ha realizado ningún estudio de investigación sobre las interferencias de la glucosa en las concentraciones de cannabinoides.

Había visto datos de aplicaciones anteriores de Waters en las que se añadía acetonitrilo (1 mL, creo) al tampón Quantisal. Esto parece ayudar a las recuperaciones. ¿Algún comentario al respecto, y cómo llegó a 1 mL de ácido fosfórico al 4%?

Llegué a añadir 0,4 mL de H3PO4 al 4% a 1 mL de OF/tampón debido a estudios anteriores validados que utilizaban esta cantidad. Además, añadir los analitos en ácido fosfórico es una práctica estándar con Oasis Prime SPE, por lo que no realicé ninguna optimización en este paso. (M. Fabritius, C. Staub, P. Mangin, C. Giroud, Analysis of cannabinoids in oral fluid by liquid chromatography-tandem mass spectrometry, in: Forensic Toxicol., 2013: pp. 151-163. doi:10.1007/s11419-012-0168-z.).

Las concentraciones de THC-COOH en el fluido oral se reportan en la concentración de picogramos/ml. Esto parece ser independiente del tampón del colector. Es decir, el fluido oral crudo y los colectores basados en el tampón siguen dando concentraciones de THC-COOH muy bajas. ¿Está usted de acuerdo?

Sé que la literatura tiene informes de THC-COOH en el fluido oral en torno a 15-450 picogramos/mL. Sé que para este estudio no pudimos alcanzar un LOQ tan bajo y tampoco creímos que muchos laboratorios fueran capaces de alcanzar ese LOQ. Por lo tanto, aunque algunos laboratorios puedan cuantificar hasta 15 picogramos/mL, ese nivel de sensibilidad requiere un procesamiento y una manipulación adicionales, lo que resulta poco práctico.

¿Podría repetir qué es lo que se mira en el estudio, aparte de la sangre, la boca y el aliento? DRE, distracción del iPad, ¿qué más?

Los 10 cannabinoides se cuantifican en el fluido oral, 8 en la sangre y sólo el THC en el aliento. Los participantes son evaluados por el simulador de conducción, el rendimiento basado en el iPad y los exámenes DRE de la policía a ciegas. También se evalúa la obediencia a las órdenes verbales (por ejemplo, después del tercer semáforo en verde, girar a la izquierda).

¿Se evaluó la extracción líquida o diluida y el disparo?

No, pero estos enfoques de pretratamiento de muestras se han probado en otros laboratorios. Debido a la presencia de estabilizadores y tensioactivos en los dispositivos comerciales de fluidos orales, la dilución y el disparo no funcionarán, ya que se producirá una supresión de iones muy elevada. La extracción líquida tampoco consigue reducir la supresión de iones cuando el fluido oral se recoge en dispositivos comerciales.

¿Cuál es la correlación entre el deterioro medido y los niveles de cannabinoides en la sangre/saliva? ¿Ha analizado ya su estudio este aspecto o lo hará más adelante?

Esto se hará al final de este estudio, una vez que tengamos 120 participantes con datos completos, se desenmascarará y entonces podremos evaluar qué concentración de cualquiera de los cannabinoides medidos está asociada con el deterioro.

¿Cómo se garantiza la uniformidad de las concentraciones de cannabinoides en los porros que se proporcionan a los participantes? ¿Cuáles son los rangos de variación?

Los porros son liados por el farmacéutico del Centro Médico de la UCSD. El estadístico le dice al farmacéutico qué tipo de marihuana debe utilizar (es decir, placebo, 5,9 o 13,4% de THC) y luego se la da al coordinador del proyecto, que se la entrega al paciente. Así, sólo el estadístico sabe a qué participante se le da qué tipo de cannabis. La cantidad enrollada en el porro es idéntica entre los tipos.

¿Cómo incorporas al estudio los antecedentes de consumo de cannabis de todos los participantes? ¿Cómo va a interpretar los resultados?

Sólo estamos inscribiendo en nuestro estudio a usuarios crónicos (diarios) y ocasionales (>3 veces por semana) para reducir el sesgo de los usuarios ingenuos. En este momento, no sé cómo manejarán mis colaboradores las diferencias en los antecedentes de los usuarios.

¿Cómo se propaga la droga en las muestras de fluidos orales? Recogimos dos muestras diferentes en dos tubos distintos y una dio positivo y la otra negativo en THC, ¿puede explicarlo?

No hemos recogido suficientes datos para comentar realmente la propagación de la droga en muestras de fluidos orales, pero hemos visto en cualquier lugar de 15 ng/mL - >4000 ng/mL de THC después de fumar. Suponiendo que se trata de dos dispositivos diferentes, es posible que los tampones patentados hayan contribuido a su sesgo.

¿Cuál sería la interpretación si hay uno de los metabolitos pero no la droga madre en la muestra de fluido oral?

Por el momento, no tenemos ninguna especulación sobre las posibles interpretaciones de las muestras, pero dicho esto, todavía no hemos tenido una muestra que sea negativa para el THC con un metabolito positivo en el fluido oral. Así que probablemente será una situación muy rara tener que especular sobre lo que podría significar.

¿Por qué considera que el THCA-A está tan retenido en la Jeringa Hamilton?

No tengo una buena respuesta a por qué el THCA-A es altamente retenido en la Jeringa Hamilton. Hemos optado por no investigar la causa y ejecutar una solución (es decir, cambiar a puntas de pipeta desechables).

Con el arrastre de la jeringa Hamilton, ¿probó a lavar con otros disolventes como el cloroformo?

No, no hemos probado a lavar con cloroformo u otros disolventes orgánicos no polares.

Hay muchas cosas que se desconocen sobre las causas de que las cepas sean (por ejemplo) "energizantes" frente a las que "se quedan en el sofá". Esos factores (por ejemplo, el complemento de terpenos) podrían afectar sin duda a la capacidad de conducción. ¿Cómo controlarías esa variabilidad?

Abordar esta cuestión es difícil, ya que la ingesta de material vegetal adopta un enfoque polifarmacéutico de la medicina (es decir, múltiples factores que causan una respuesta a la que es difícil contribuir con un solo compuesto). Sin embargo, el componente psicoactivo del cannabis es el THC, por lo que, independientemente de los demás factores que contribuyan, si el THC acaba estando asociado con la alteración de la OF a un determinado nivel, esperamos que eso se mantenga en las diferentes variedades de plantas. Se trata de una cuestión compleja, pero la investigación futura sobre los perfiles de las cepas de plantas es un tema que debe estar mejor regulado y controlado para desentrañar los posibles efectos perjudiciales.

¿Qué tipo de tareas se evaluaron en el iPad?

La tarea del iPad consistía en determinar si el sujeto era capaz de seleccionar la burbuja más grande que todas las demás. Se evaluará el tiempo empleado en seleccionar la burbuja correcta.

Nuestro grupo mide la función/visión de la retina con el uso agudo, pero no tiene la capacidad de determinar la biología. Estamos encontrando en nuestro limitado conjunto de datos, diferencias "de planta". Nuestras investigaciones anteriores en la EA y la EP han demostrado que los errores en las pruebas neurológicas de las tabletas a menudo reflejan la disfunción de la visión en lugar de la cognitiva. Sus métodos y su capacidad para medir numerosos cannabinoides serán importantes. ¿Tiene medios para determinar el funcionamiento no cognitivo?

Hay órdenes verbales que se dan al sujeto para evaluar la atención que no se vería afectada por la disfunción de la visión. Este aspecto del proyecto está supervisado por mis colaboradores del departamento de psicología y sería mejor dirigirse a ellos, ya que mi experiencia es limitada en ese ámbito de investigación.

Las investigaciones más antiguas sobre la visión (de los años 70 en Berkeley) encontraron curvas de pico y disipación similares a las suyas, es decir, un pico en torno a los 10-15 minutos que se disipaba en 1,5 horas. Se trataba de pruebas funcionales de deslumbramiento de la retina. ¿Alguna de las pruebas funcionales coincide con estos picos y curvas de disipación?

Sigo siendo ciego a cualquiera de las pruebas funcionales y mis colaboradores son ciegos a cualquiera de los valores de laboratorio hasta la finalización del estudio.

La audición y la visión son disfuncionales con el uso agudo de la marihuana. Huestis informa de la formación de túneles, pero no hay estudios identificados hasta la fecha. Estamos encontrando tunelización. Informado en ARVO este año.

Estoy ciego a cualquiera de las evaluaciones funcionales, los simuladores y los resultados del examen DRE.

Entonces, si el NIH, limitado en CBD entonces? ¿Cuál es el máximo que puede obtener el CBD?

Dado que obtenemos nuestra marihuana del gobierno, estamos limitados en cuanto a las cepas y la potencia que podemos probar. No sé cuál es la cantidad máxima de CBD disponible en el NIH.

¿Ha considerado utilizar el método de desplazamiento de tiempo y luego mirar la correlación entre la sangre y la OF? Por ejemplo, si los compuestos se absorben después de 15 minutos, ¿utilizar la sangre de 15 minutos con tiempo cero oral?

No, no hemos considerado realizar ningún cambio de tiempo en nuestros datos en este momento. El análisis de los datos se llevará a cabo al final del estudio y existe la posibilidad de que las correlaciones mejoren una vez que estratifiquemos a los pacientes (es decir, con discapacidades o sin ellas, o con placebo o con THC bajo o alto, etc.).

¿Por qué sólo el IS deuterado?   

Los estándares internos deuterados se utilizan habitualmente para los metabolitos de los cannabinoides. Los estándares internos de 13C podrían utilizarse potencialmente.

No olvide consultar el seminario web a la carta.

Más información sobre las tecnologías de Waters para forensic toxicology aplicaciones:

• ACQUITY UPLC I-Class PLUS System
• Xevo TQ-S micro Mass Spectrometer