L'intégrité des données est importante : Limiter l'accès aux outils qui pourraient être utilisés pour manipuler les données (partie 4)

Suppression des pics d'intégration

La possibilité d'optimiser l'intégration et l'identification des pics, que ce soit en réinitialisant les paramètres RT de la méthode, en identifiant manuellement les pics ou en supprimant l'intégration de pics spécifiques connus, est certainement un outil qui, entre de mauvaises mains, avec une mauvaise intention et sans un processus de formation et d'examen solide, peut être utilisé par un personnel peu scrupuleux pour manipuler frauduleusement un résultat défectueux en une spécification positive.

Nous avons présenté précédemment ces quatre scénarios préoccupants

1. Préparation du système /Essais /Injections d'équilibrage
2. Tentatives multiples d'optimisation des paramètres d'intégration pour obtenir une intégration précise
3. L'utilisation de l'intégration manuelle pour obtenir une intégration précise
4. Suppression de l'intégration des pics pour éliminer certains pics de l'analyse.

Dans ce blog, nous nous pencherons sur le quatrième scénario et sur le besoin légitime d'exclure les pics des calculs, sur la manière dont l'intégration inhibitrice ou d'autres outils d'intégration ont traditionnellement été utilisés à cette fin et sur les raisons pour lesquelles les régulateurs craignent que la suppression de l'intégration des pics soit utilisée de manière incontrôlée pour masquer les pics indésirables.

Des outils utiles peuvent être utilisés pour obtenir des résultats précis et cohérents, mais aussi, entre de mauvaises mains ou si quelqu'un en a l'intention, ils peuvent être utilisés pour falsifier des données. Comment faire la différence ?

Comme nous l'avons vu précédemment, les chromatogrammes obtenus expérimentalement, à partir de détecteurs surveillant des composés spécifiques dissous dans une phase mobile en mouvement, passant sur une phase stationnaire traitée chimiquement, ne se comportent malheureusement pas parfaitement selon une quelconque théorie chimique ou physique. Outre la forme imparfaite et non gaussienne des pics, des considérations liées à l'environnement et au débit de la phase mobile auront certainement un impact sur la ligne de base idéalement lisse. Par exemple, il est bien connu que l'introduction de l'échantillon, connue sous le nom d'injection, provoquera, dans presque tous les cas, une perturbation distincte de la ligne de base qui est utilisée par les scientifiques pour indiquer le volume vide de la colonne (ou Vo). De plus, surtout en chromatographie à gradient, le changement chimique progressif de la phase mobile effective par l'introduction d'une seconde phase mobile, crée généralement une pente à la ligne de base, qui revient ensuite au point de départ initial lorsque l'analyse revient aux conditions initiales. Ces conditions de gradient peuvent également être utilisées pour "laver" la colonne et éliminer les composés fortement retenus qui ne font pas réellement partie de l'échantillon analysé. Ces composés ne faisant pas partie de l'échantillon peuvent provenir de la phase mobile, du diluant d'injection ou d'une partie du processus de préparation de l'échantillon.

Vous pouvez deviner que les perturbations de la ligne de base décrites ci-dessus se trouvent généralement dans la première ou la dernière partie d'un chromatogramme. Ces types de perturbations ou de pics de la ligne de base sont également observés dans les injections à blanc, qui sont essentielles pour la validation des méthodes, mais aussi souvent pendant les analyses d'échantillons. Comme les paramètres d'intégration de la ligne de base peuvent les considérer comme de véritables pics chromatographiques de l'échantillon, il est très courant de demander au logiciel chromatographique de retarder le début de l'intégration des pics ou de la terminer plus tôt, afin d'éviter d'intégrer ce que l'on appelle les "pics du système", car ils ne sont pas représentatifs de la composition de l'échantillon. Dans de nombreux cas, lorsqu'une étape de lavage de la colonne crée un bruit de ligne de base extrême, l'acquisition des données peut être arrêtée une fois que tous les vrais composants ont été élués.

D'autres types de pics "non-échantillon" peuvent également apparaître dans des zones autres que le début et la fin d'un chromatogramme. Les pics causés par des additifs dans le diluant d'injection, par exemple, peuvent être élués entre les véritables pics de l'échantillon. Bien entendu, ces pics sont également visibles dans les injections à blanc.

La figure 1 montre une injection à blanc (mise à l'échelle automatique pour remplir l'écran) qui montre tous les effets du système dans le chromatogramme.

La figure 2 montre comment une injection standard (bleu) superposée au blanc (noir) présente les pics réels de l'étalon mais inclut également les pics du système et la perturbation de la ligne de base du gradient qui sont visibles dans le blanc.

Il est clair que ces pics hors échantillon ne doivent pas être inclus dans les résultats d'analyse des échantillons. Mais leur exclusion doit être clairement expliquée dans la méthode et justifiée scientifiquement. L'exclusion correcte des pics du système ou du diluant doit faire partie de l'examen par la deuxième personne, en tant que contrôle de qualité pour s'assurer que les pics authentiques de l'échantillon (ou les nouvelles impuretés de l'échantillon) n'ont pas été oubliés.

Comment ces effets de système sont-ils exclus de l'évaluation chromatographique ? L'approche normale consiste à empêcher l'intégration de ces pics. Cela est nécessaire, en particulier lorsque l'évaluation de l'échantillon utilise des valeurs telles que Area% ou Amount% où ces pics supplémentaires perturberaient le résultat final s'ils étaient inclus dans les totaux. Il est également courant d'exclure les très petits pics de ce type de calcul, par exemple ceux qui, à la première intégration, représentent moins de 0,5 % de la surface totale.

Le paramètre le plus typique de la méthode d'intégration utilisée a été mentionné ci-dessus, il est presque universellement connu sous le nom d'intégration inhibitrice. Tous les systèmes CDS disposent d'une telle fonction qui retarde le début de l'évaluation des pics au début du chromatogramme ou arrête la détection des pics à un moment précis une fois que les pics critiques ont été élués. Le placement de ces événements est essentiel pour éviter de supprimer l'intégration d'un composant réel de l'échantillon. Comme les effets des lignes de base se produiront dans tous les tests injectés, cette intégration inhibée sera utilisée aussi bien dans les standards que dans les injections d'échantillons. Cependant, il est également important d'inclure des injections à blanc pour justifier le placement des événements d'intégration d'inhibition.

Mais il existe d'autres événements d'intégration qui peuvent être utilisés pour supprimer la détection des pics. Il s'agit notamment, mais pas exclusivement, de la définition d'une surface ou d'une hauteur minimale chronométrée, ou simplement de la définition d'un seuil élevé ou d'une valeur de largeur de pic à des endroits spécifiques du chromatogramme. Chacun de ces événements peut être légitimement nécessaire pour une intégration correcte des pics ou pour supprimer la fluctuation de la ligne de base connue sous le nom de bruit, mais il peut également être utilisé pour exclure un pic choisi.

Pour cette raison, il y a eu des observations réglementaires suggérant que les événements d'intégration de pic, en particulier ceux qui suppriment l'intégration de pic, pourraient être utilisés frauduleusement pour manipuler les données chromatographiques. En 2017, une lettre d'avertissement a été émise avec une observation selon laquelle le logiciel était "configuré pour permettre une utilisation extensive de la fonction "inhiber l'intégration" sans justification scientifique". La lettre décrivait ensuite comment, dans certains tests d'impuretés, la fonction "inhibition de l'intégration" était utilisée.Le logiciel était configuré pour inhiber l'intégration des pics à quatre périodes différentes". Bien sûr, il n'est pas possible de savoir si l'utilisation ici était justifiée ou non, mais dans les anciennes méthodes basées sur les UV, cela peut avoir été simplement utilisé pour éliminer les pics du système ou du diluant, comme ceux qui apparaissent dans mon injection de blanc de phtalate ci-dessus à environ 2,4 minutes.

Bien que cette lettre d'avertissement vise spécifiquement les événements d'inhibition de l'intégration, le fait d'interdire ou de restreindre l'accès à ce seul événement ne résout pas le problème sous-jacent, car d'autres paramètres d'intégration légitimes peuvent également être utilisés pour dissimuler des pics à l'évaluation.

Il existe d'autres solutions pour traiter les pics de système qui apparaissent dans les blancs. Si la chromatographie, avec ses particularités, a des temps de rétention et des réponses aux pics stables, la soustraction de la ligne de base pourrait être utilisée pour éliminer les pics du système. Dans mon exemple, cela pourrait convenir pour éliminer les pics à 2,4 minutes, mais moins utile pour éliminer les pics avant 1 minute qui ne se superposent pas directement. Dans de nombreux cas, les complications telles que les pics de système sont résolues en contournant les calculs du CDS et en effectuant tout l'étalonnage et la quantification à l'aide d'applications externes comme les LIMS ou même les feuilles de calcul Excel. Dans ce cas, il est très facile de choisir les pics à inclure dans les calculs et ceux à ignorer, avec une faible traçabilité.

Dans un LC-GC webcastAu cours de la conférence, Neil Lander et moi-même avons montré comment les nouvelles fonctionnalités d'Empower permettent de désigner des pics de blanc, de diluant ou de système. Les analystes peuvent alors permettre leur intégration et la production de rapports, mais ils peuvent aussi configurer des calculs spécifiques dans la fonctionnalité d'analyse des impuretés pour inclure ou exclure ces pics désignés. Ceci peut être configuré et testé pendant la validation de la méthode pour montrer que les méthodes Empower sont utilisées de manière appropriée. Vous pouvez également consulter cette astuce du blogue Empower Tip of the Week sur ce sujet de l'analyse des impuretés. (Conseil n°41)

Dans le prochain billet, j'expliquerai comment cette intervention spécifique de l'analyste dans la définition des paramètres de traitement pourrait être un facteur dans les récentes préoccupations concernant les impuretés de nitrosamine (NDMA, NDEA) dans les médicaments cardiaques connus officiellement sous le nom d'ARA et officieusement sous le nom de "sartans", ainsi que dans les médicaments antiacides courants en vente libre contenant de la ranitidine.