Maximiser la durée de vie des colonnes LC : 3 conseils pour réduire la détérioration chimique

Kevin Jenkins

Temps de lecture : 6 minutes

Le laisser dans la boîte ? Le conserver dans la phase mobile ? Lire le manuel ?

Toutes les colonnes chromatographiques ont une durée de vie limitée qui dépend fortement de leur entretien et de leur utilisation. Même dans les meilleures conditions, les colonnes HPLC et UPLC se détériorent avec le temps en raison d'une contamination chimique ou particulaire.

La plupart des limitations de la durée de vie des colonnes ne sont pas dues à la colonne, mais à d'autres facteurs qui peuvent être attribués à la détérioration chimique ou à la contamination physique. Certains de ces facteurs sont inévitables et font partie d'une utilisation normale.

Pour obtenir une durée de vie et des performances maximales de votre colonne LC analytique, il suffit de suivre trois recommandations simples pour réduire la détérioration chimique.

1. Connaître les conditions de fonctionnement de votre colonne

Je sais que cela semble évident, mais le respect des directives du fabricant concernant les plages opérationnelles pour la température de la colonne, le pH de la phase mobile et les additifs de tampon améliorera considérablement la durée de vie et les performances de la colonne.

Les fabricants de colonnes testent intensivement les colonnes sur une large gamme de conditions opérationnelles afin de garantir leur robustesse et leurs bonnes performances. Heureusement, ces informations sont incluses dans les manuels d'entretien et d'utilisation de la plupart des colonnes. Accordez une attention particulière à la section "Utilisation de la colonne" du manuel de la colonne, qui contient généralement des recommandations pour la préparation des échantillons, des directives sur la gamme de pH, des informations sur les solvants, ainsi que des conseils sur la pression maximale de fonctionnement.

Par exemple, les garnissages en phase inversée à base de silice sont très stables à température ambiante pour la plupart des conditions de phase mobile entre pH 2 et 8 ; les particules de silice hybride étendent la plage de pH opérationnelle de 1 à 12. Cependant, si vous augmentez la température, en particulier lorsque vous travaillez à proximité des limites de pH du matériau de garnissage, la durée de vie de la colonne peut se détériorer rapidement. Cela pose des problèmes, en particulier pour de nombreuses méthodes USP qui fonctionnent à un pH proche de 7. Si l'on combine ces conditions avec des températures élevées de la colonne, il est fort probable que la dissolution de la particule à base de silice provoque une défaillance précoce de la colonne.

Cela crée généralement un vide dans la phase stationnaire à l'entrée de la colonne, ce qui entraîne une distorsion de la forme des pics et, dans les cas extrêmes, une division des pics.    

Dans des conditions de pH de la phase mobile plus faibles, le ligand peut potentiellement s'hydrolyser et se détacher de la surface de la phase stationnaire, ce qui entraîne une augmentation de la queue de pic et une réduction de la rétention de l'analyte.

Le choix des ions tampons utilisés dans la phase mobile joue un rôle important dans la dégradation de la colonne. Les tampons phosphates sont couramment utilisés mais ne sont pas le meilleur choix ; de bien meilleurs résultats peuvent être obtenus avec des tampons à base organique comme le TRIS ou le citrate. En général, les tampons à base organique sont moins agressifs envers la surface à base de silice. La concentration du tampon contribue à la durée de vie de la colonne : des concentrations de tampon plus faibles entraînent une meilleure durée de vie de la colonne.

Dans certains cas, il est inévitable de travailler dans ces conditions extrêmes. Les conditions de séparation doivent être mises en balance avec la robustesse de l'essai. Cependant, même dans des conditions plus stressantes, il est possible d'obtenir une bonne durée de vie des colonnes en suivant les directives de fabrication.

2. Assurer un équilibrage et un conditionnement appropriés de la colonne

L'équilibrage de la colonne est simple, le temps d'équilibrage dépendant de la composition et de la concentration de la phase mobile. En général, les conditions de phase mobile plus concentrées nécessitent moins de temps d'équilibrage que les compositions plus diluées. Cela est dû à la cinétique entre la phase mobile et la phase stationnaire, les phases mobiles plus diluées conférant une concentration de surface plus faible à la phase stationnaire.

Le facteur clé pour l'équilibrage de la colonne est le volume de la phase mobile, et non le temps. En général, il est recommandé d'utiliser 5 à 10 volumes de colonne vide pour un équilibrage correct de la colonne.

Il existe des différences entre l'équilibrage de la colonne et le conditionnement de la colonne - ces deux termes ne doivent pas être confondus.

L'équilibrage de la colonne comprend tous les phénomènes qui sont réversibles, tandis que le conditionnement de la colonne modifie la colonne de manière irréversible. Le conditionnement de la colonne peut avoir un impact significatif sur la durée de vie de la colonne. Lorsque vous conditionnez une colonne, vous modifiez le produit que le fabricant vous a livré, et la reproductibilité de cette étape est de votre responsabilité.

Il est généralement déconseillé de conditionner, mais il y a des circonstances où cela est inévitable. Par exemple, de nombreuses séparations par appariement d'ions nécessitent un équilibrage et un conditionnement importants de la colonne avant d'obtenir des temps de rétention stables. Dans ce cas, les additifs interagissent avec la surface de la phase stationnaire pour conférer l'effet chimique souhaité. Pour cette raison, les colonnes qui ont été conditionnées de cette manière doivent être dédiées à ce dosage et à ces conditions de séparation spécifiques.

Une fois conditionnée, la colonne fonctionnera rarement de manière fiable pour des séparations à usage général et doit être évitée pour le développement de nouvelles méthodes.

3. Stockage correct de la colonne

 

Il existe de nombreuses manières différentes de stocker une colonne HPLC qui ont peu d'effet sur la longévité de la colonne. Le choix des conditions de stockage est assez large et peut être basé sur la commodité.

La manière la plus pratique de stocker la colonne est de la stocker dans la phase mobile dans laquelle elle est couramment utilisée. Le principal avantage de cette approche est que l'équilibrage de la colonne avec la phase mobile est très rapide. Cette approche est particulièrement recommandée pour la chromatographie en phase normale, où les changements de solvant de stockage peuvent entraîner une longue période d'équilibrage.

Il est nécessaire de bien réfléchir à cette approche. Les conditions idéales de stockage d'une colonne de chromatographie dépendent du type de phase stationnaire. Les colonnes à phase liée se modifient souvent lentement lorsqu'elles sont stockées avec des phases mobiles et des additifs courants. Par conséquent, la commodité du stockage de la colonne dans la phase mobile doit être mise en balance avec la réduction de la durée de vie de la colonne. Les colonnes C18 et C8 couramment utilisées sont suffisamment stables pour être utilisées pendant plusieurs mois sans que leur hydrophobie ne change beaucoup. Cependant, les phases liées à base de chaînes plus courtes peuvent s'hydrolyser de façon mesurable en quelques semaines.

Les meilleures conditions de stockage des colonnes en phase inversée dépendent de la fréquence de leur utilisation. Si la colonne est utilisée quotidiennement, ou même tous les quelques jours, il est plus pratique de la laisser dans la phase mobile utilisée pour la séparation. Pour un stockage à plus long terme, de nombreux fabricants de colonnes recommandent de rincer la colonne des sels tampons.

Le "lavage" de la colonne, c'est-à-dire l'utilisation d'un solvant de rinçage censé dissoudre les contaminants adsorbés - en plus de l'élimination des tampons de la phase mobile - pour prolonger la durée de vie de la colonne, est lié au stockage. Dans de nombreux cas, ce processus plus agressif ne fonctionne tout simplement pas. Par exemple, si les contaminants sont des protéines qui ont précipité sur la colonne, au moment où vous essayez de les laver, elles ont vieilli par dénaturation ou par réticulation, ce qui les rend impossibles à solubiliser.

Plus en rapport avec le stockage de la colonne, chaque lavage ou changement de solvant élimine également la phase liée hydrolysée, qui reste autrement en équilibre local au site où l'hydrolyse s'est produite. Un rinçage fréquent et inutile peut en fait entraîner un vieillissement accéléré de la colonne en éliminant le ligand lié.

Les conseils présentés ci-dessus concernent les interactions chimiques courantes qui sont souvent négligées mais qui restent importantes pour maximiser la durée de vie de la colonne.

 

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