Retenu ou non ? A partir de quand la rétention est-elle suffisante ?

Dans les différents documents que nous avons publiés à Waters sur les pesticides hautement polaires, comme le glyphosate ou le chlorméquat, l'un des principaux paramètres dont nous discutons est la rétention. Mais qu'entendons-nous par le mot rétention ?

• Le temps de rétention (RT) est le temps qui s'écoule entre le début d'une injection et l'apparition du pic maximal de l'analyte ou des^analytes1.

Cependant, nous devons connaître le degré d'interaction de l'analyte avec le matériau de la phase stationnaire (le temps relatif d'interaction avec la phase stationnaire par rapport à la phase mobile).

• Le facteur de rétention (k), qui était auparavant appelé facteur de capacité, est la mesure du temps pendant lequel le ou les analytes cibles résident dans la phase stationnaire par rapport au temps pendant lequel ils résident dans la phase mobile1.

Si cette interaction est trop courte, il n'y a pas ou peu de chromatographie, les séparations seront moins stables et il y aura de fortes chances de suppression d'ions lorsque la LC-MS est utilisée.

• Le volume vide de la colonne (v) est une mesure du volume interne de la colonne remplie de particules de phase stationnaire et peut être estimé à partir de la longueur (L) et du diamètre interne (ID) de la colonne.
• Volume vide de la colonne (µl) = 0,66 x π x (diamètre interne de la colonne/2^{)2 x} L

Pour la plupart des colonnes Waters remplies de particules totalement poreuses, une valeur de "volume de pore" de 0,66 peut être utilisée. Les particules superficiellement poreuses(par exemple, un noyau solide) ont moins de volume, de sorte qu'une valeur de 0,49 est souvent utilisée.

par exemple, pour une colonne ACQUITY HSS T3 de 3,0 mm x 100 mm, v = 0,467 mL

Connaître le volume de vide de la colonne et le débit utilisé permet de calculer le temps de vide de la colonne (t0) :

t0 = V/F

Une réponse plus précise sera trouvée en mesurant le volume vide de votre colonne lorsqu'elle est installée dans le système LC en injectant un composé que vous savez non retenu.

L'exemple ci-dessus illustre la rétention d'un pesticide relativement polaire, le méthamidophos, dans des conditions typiques de chromatographie liquide (CL) en phase inversée multi-résidus.

Les directives relatives au contrôle de la qualité analytique, aux performances et à la validation des méthodes, telles que SANTE/12682/20192 et la décision 2002/657/CE de la Commission3, stipulent que "le temps de rétention minimal acceptable pour le ou les analytes doit être au moins le double du temps de rétention correspondant au volume vide de la colonne".

Dans l'exemple ci-dessus, vous pouvez voir que la colonne et les conditions LC utilisées permettent une rétention suffisante du méthamidaphos, conformément aux directives de SANTE.

Si l'on considère également le facteur de rétention (k), la mesure de la rétention d'une colonne par rapport au temps de vide de la colonne (t0) :

k = (tR - t0)/ t0

S'assurer que le pic d'élution le plus précoce a une valeur pour k >1,0 et de préférence >1,5.

Lorsque l'on est confronté à des analytes encore plus polaires, comme les pesticides polaires ioniques, les mêmes règles s'appliquent, quel que soit le choix du système chromatographique. Il est très peu probable qu'une rétention suffisante soit assurée pour de tels composés en utilisant les flux de travail typiques en phase inversée.

Le chromatogramme ci-dessous montre l'analyse LC-MS/MS d'un composé hautement polaire, l'éthylène-thiourée (ETU).

Il s'agit d'un exemple de chromatogramme obtenu au début du développement d'une méthode, sur une colonne HILIC (2.1 x 50 mm, 1.7 µm) avec un débit de 0.2 mL/min.

• Le volume du vide pour cette colonne de 2,1 x 50 mm est de 0,114 ml.
• Le débit est de 0.2 mL/min donc t0 est de 0.57 minutes (2 x t0₌₁ .14 min)

Le temps de rétention de l'ETU dans ce cas est inférieur à deux fois le temps de vide de la colonne (t0) avec les conditions de phase mobile qui ont été utilisées.

Les options pour la rétention et la séparation des analytes hautement polaires peuvent inclure la chromatographie ionique, les colonnes poreuses en graphite/carbone graphitique et la chromatographie HILIC/mode mixte. Le chromatogramme suivant montre la rétention de divers pesticides polaires anioniques en utilisant la colonne APP (Anionic Polar Pesticide) de Waters.

La phase stationnaire de la colonne est constituée de particules hybrides pontées par de l'éthylène (BEH) avec des ligands de diéthylamine (DEA) liés de manière trifonctionnelle. La combinaison de la surface hydrophile et des propriétés d'échange d'anions des ligands fournit des caractéristiques chromatographiques bien adaptées à la rétention et à la séparation de composés anioniques hautement polaires.

Dans ces conditions4, en utilisant une colonne APP de 2,1 mm x 100 mm avec un débit de 0,5 mL/min, t0 est de 0,46 minute, de sorte que le TR pour l'AMPA, le premier pic à éluer, est de 3,5 x t0, ce qui est bien conforme aux directives SANTE.

Ainsi, si vous développez une méthode LC à partir de zéro ou si vous mettez en œuvre une méthode existante prise ailleurs, ne vous concentrez pas uniquement sur la valeur du temps de rétention, mais essayez de faire en sorte que le temps de rétention de l'analyte soit au moins le double du temps de rétention correspondant au volume vide de la colonne, dans les conditions utilisées.

1. Annexe : Nomenclature HPLC, Waters Corporation : https://www.waters.com/waters/en_US/Appendix%3A-HPLC-Nomenclature/nav.htm?cid=10049080&locale=en_US
2. Document n° SANTE/12682/2019. Procédures de contrôle de la qualité analytique et de validation des méthodes pour l'analyse des résidus de pesticides dans les denrées alimentaires et les aliments pour animaux.
3. 2002/657/CE : Décision de la Commission du 12 août 2002 portant application de la directive 96/23/CE du Conseil concernant les performances des méthodes d'analyse et l'interprétation des résultats et Contaminants 22(3): 245–250. http://dx.doi.org/10.1080/02652030500110618
4. Détermination des pesticides polaires anioniques dans les denrées alimentaires à forte teneur en eau, Waters Technology Brief 720006645 (2020)