开发生物仿制药的分析工具。第2部分，肽的分析

Scott Berger

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高分辨率分析法在创新药和生物仿制药表征方面的进展

英夫利西单抗生物仿制药。肽水平上的分析比较

在下列情况下 biosimilar comparability study of infliximab 由Waters科学家进行的研究，使用带有UNIFI的Waters生物制药平台解决方案对三批创新药英夫利西单抗（在SP2/0小鼠细胞系中生产）和三批候选生物仿制药英夫利西单抗（来自CHO细胞）进行了比较。

样品在完整的蛋白质、蛋白质亚单位、蛋白质消化物、释放的聚糖部分的水平上进行分析，并分析聚集和电荷变异情况。在大多数工作流程中，六个样品中的每一个都以一式三份进行分析，以建立基线分析的可重复性。

主要结构（即序列）的确认对于确定 biosimilarity 与创新者产品。这个问题可以在以下层面间接解决 完整的抗体质量分析 和抗体亚单位质量分析研究，但需要高覆盖率的 肽的映射 研究证明了蛋白质链中氨基酸的线性顺序。这些分析也有助于定义产品的属性变化，如 糖基化，终端处理，以及其他蛋白质的修饰。

 

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在这个由三部分组成的系列中，我们将回顾分析型液相色谱和质谱技术如何与软件和信息学相结合，在三个层面上促进生物仿制药的开发。

缩减的多肽图谱

确认主要结构（序列）是验证潜在生物仿制药真正候选资格的关键。确认IgG主要结构的一个标准方法是在二硫还原的样品上进行UPLC/MSE肽图。减少的UPLC/MSE肽图可以帮助突出和识别候选生物仿制药和创新药之间的蛋白质序列和修饰变体之间的差异。MSE是一种独立于数据的质谱采集技术，在肽图分析中对所有的肽进行定量质谱和质谱碎片数据采集。

二硫还原（二硫苏糖醇）的肽图样本被烷基化，并通过UPLC/MSE进行分析，以满足建立与创新者的蛋白质序列可比性的要求，并确定改性肽变体和确定其相对丰度。

所有的多肽图谱实验都是在一台电脑上进行的。 ACQUITY UPLC Peptide BEH C18, 1.7-μm, 2.1 x 150 mm色谱柱，在同一色谱柱上。 使用UNIFI的生物制药平台解决方案 仪器配置（UPLC与QTof MS），用于完整的质量分析。数据被自动获取、处理，并使用UNIFI科学信息系统进行报告。创新药和生物仿制药的轻链和重链都获得了相同的高蛋白覆盖率。质谱E 分析证实了生物仿制药和创新药英夫利昔单抗样品中末端肽的序列。

虽然基于胰蛋白酶的分析确定了肽水平的可比性，但监管要求是确定创新者和生物仿制药产品中氨基酸的绝对序列的可比性，不包括常见的加工修改，如重链上的C端Lys。这一要求的现实是，需要进行更广泛的图谱研究，通常采用其他互补的消化酶，以确认蛋白质内每个肽键的片段达到可接受的确定性水平。

肽图谱和生物仿制药可比性工作中遇到的一个典型挑战是对创新药和候选生物仿制药的肽修饰的检测、监测和定量比较。在一个例子中，HC肽T24包含一个 "热点 "xxxDGxxx序列，具有Asp异构化的高潜力，其中天冬氨酸非酶性转化为异天冬氨酸。IsoAsp有可能具有免疫原性，能影响生物活性，并能改变治疗性多肽和蛋白质药物的药代动力学。这种异构产物通常会在UPLC图谱条件下从未修饰的肽中分离出来，而且修饰的肽将与未修饰的肽拥有共同的质量。

处理结果显示，创新药英夫利昔单抗中的T24肽大约含有0.2%的IsoAsp变体，而候选生物仿制药中的变体水平为0.1%。这种可靠地检测、识别和量化低水平变异肽形式的能力对于论证生物相似性的可信度至关重要。

非还原肽图谱

蛋白质的结构确实决定了功能，在生物相似性研究中，确定高阶或三维结构的保守性是很重要的。这不仅包括一些物理化学研究（CD、HDX、NMR、AUC......），在此不作讨论，而且还包括初级结构研究的延伸：确定Cys-Cys二硫键模式。二硫键的形成在稳定三维折叠结构和保持治疗性蛋白质的生物活性方面起着关键作用。

在治疗性蛋白质的生产过程中，在下游加工步骤中，或者当纯化的生物治疗样品暴露在环境压力下时，都可能发生二硫扰动（误配对）。二硫断裂和扰乱可以表现为蛋白质的错误折叠和产品的聚集。因此，确认预期的二硫化物连接的存在，并证明治疗性蛋白质中不存在扰乱的二硫化物，对于确保药物质量和满足监管部门的要求至关重要。

二硫键连接性或结合模式通常由非还原肽图确定。英夫利昔单抗含有16个S-S键（12个链内键和4个链间键），与IgG1分子对称，在非还原图中产生8个独特的二硫键肽。英夫利西单抗样品被变性、烷基化，并用胰蛋白酶消化，产生非还原消化物，用于UPLC/MSE分析。

UNIFI软件被用来自动进行UPLC/MSE数据采集、处理和报告英夫利西单抗候选生物仿制药的非还原肽图。UNIFI软件的数据审查和报告部分有一个数据过滤功能，可以对数据进行自定义查看，将数据限制在只显示含二硫化物的肽。

在对数据进行过滤后，所有8个预期的二硫键合肽都在创新者和生物仿制药样品的批次中得到了确认，并且都通过UPLC/MSE采集的片段离子进行了确认。在随后的搜索中，为了限制组合搜索的要求，采用了更有限的在线消化和可变修饰搜索标准，在创新药和候选生物仿制药中都没有检测到扰乱的二硫化物的证据。

请看我们的方法和数据。 automated disulfide bond mapping study 将创新者与英夫利西单抗生物仿制药进行比较。

下一个。糖基化、聚集和电荷变体分析

 

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