避免PCR试剂紧缺。高效液相色谱预备柱的作用

尼克-赞帕

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PCR引物探针

PCR引物探针基于PCR的关键SARS-CoV-2诊断法也未能幸免于难。 供应链中断 在COVID-19大流行期间如此常见。虽然 对基于PCR的测试的最大破坏 是RNA提取试剂盒、酶和PCR引物也受到了影响。在沃特世，我们一直密切关注高质量的制备型HPLC柱在PCR引物和探针供应链中发挥的作用。随着我们在这次大流行中不断前进，我们将继续帮助确保诊断和常规使用的PCR引物和探针的充足质量和供应。

关于RT-PCR引物和探针的背景

及时诊断SARS-CoV-2病毒感染是管理新型冠状病毒大流行的关键所在。事实上，COVID-19告诉我们，早期提供高质量的诊断方法对成功管理大流行病至关重要。

许多在美国和欧盟获得紧急使用授权的COVID-19检测方法采用RT-PCR诊断试剂盒，在扩增和检测期间使用寡核苷酸作为引物和探针。

  • 荧光RT-PCR探针（双标记）。RT-PCR探针是与感兴趣的特定目标序列结合的寡核苷酸。探针的5'端连接着一个报告荧光体，而3'端连接着一个淬灭体。淬灭剂和荧光体的接近会抑制荧光信号。在扩增过程中，一个逆转录酶将DNA从5'端转录到3'端。这就从探针和淬灭剂中释放出荧光团，从而产生可测量的荧光信号。
  • PCR引物。PCR引物是短的单链寡核苷酸，在感兴趣的目标序列前面结合。DNA聚合酶，包括逆转录酶，只能从现有的链上按5'到3'的方向转录DNA，而不能单独从模板链上创造新的DNA。因此，PCR反应需要寡核苷酸引物。

高效液相色谱制备柱和RT-PCR诊断法

了解制备型HPLC柱对生产RT-PCR诊断的重要性，可以分为两个问题。

在大流行期间，RT-PCR诊断测试最重要的性能参数是什么？

它的敏感性！"。

在大流行病期间，避免假阴性是至关重要的。控制疾病的传播要求我们不要错误地将病人诊断为没有患病，而实际上他们是有的。因此，诊断测试最重要的性能参数是灵敏度。需要分析灵敏度和足够低的检测限（LoD）来确保最小的假阴性。

PCR引物探针2

那么，制备型HPLC柱与灵敏度有什么关系？

这是关于纯洁性!

正如我在与我们的客户合作者交谈时了解到的，建议采用反相HPLC纯化（主要是离子配对），以达到足够敏感和准确的基于PCR的诊断测试所需的引物和探针纯度。太多的N-1失败序列会导致灵敏度的降低。你的引物中的碱基不对，而且对感兴趣的目标没有特异性。游离的荧光标签和你的背景噪音增加。缺少一定比例的探针中的荧光基团或淬灭剂，灵敏度可能会降低。

虽然对纯度的要求因测试和公司而异，但纯度>85%经常被要求。通过对一些世界领先的寡核苷酸制造商的快速搜索，你会发现关于不同类型PCR引物和探针的纯化技术的专家指导。对于敏感的PCR检测，特别是那些用作诊断的PCR检测，几乎普遍建议采用HPLC纯化。

最终，诊断试剂盒制造商寻求减少因引物和探针质量差或不纯而导致PCR扩增失败的风险。虽然诊断性能是纯度以外的各种参数的组合，但纯度是设计检测试剂盒时可以控制的一个因素。

Waters制备型HPLC柱和PCR引物和探针供应

我们可以通过回答三个问题来解决PCR引物和探针供应与Waters制备型HPLC柱之间的联系。

制备型HPLC柱和引物/探针供应链之间有什么联系？

通过使制造商满足诊断性PCR探针的高纯度要求，制备RP-HPLC柱是确保为COVID-19提供足够的基于PCR的敏感诊断的关键组成部分。正因为如此，使用能够达到所需纯度并提供足够产量的高质量色谱柱是可取的。由于色谱柱具有更高的容量和更好的分辨率（导致更好的纯度），因此通常选择HPLC而不是基于柱子的格式。这种更高的容量和纯度的结合对于在大流行病中紧急生产高需求的材料可能是至关重要的。

好吧，那么在净化过程中，有什么问题可能会影响到我的供应？

  • 想象一下，一根柱子在运行过程中不可预测地作废或失效。你失去了你的运行。你失去了你的样品。你被延误了。
  • 想象一下，你已经在分析规模上开发了你的方法，应用了良好的缩放规则，但突然间，在制备规模上的表现是一场噩梦。回到绘图板。更多的延迟。
  • 想象一下，收到一个与前一列相同或不同批次的新列。你开始运行并注意到它的性能并不一样。你可能需要重新开发或优化你的方法，以考虑到这种增加的变异性。再次延迟。
  • 想象一下，你订购了一根柱子，却听到你的供应商说供应延误了。你能把这种材料运出门外吗？

生产的延迟可能会导致病人测试的延迟。在迫切需要的时候，你没有时间来处理这些挑战。你想在第一次就把它做好，每次都是如此。

很好，但沃特斯能提供什么来帮助我在最后期限前完成工作？

在沃特世，我们通过为您提供高质量、创新和可用的解决方案，努力降低您面临的这些故障风险。为应对上述每一项挑战提供保证，需要有专门的解决方案。

  • Pr成熟的空隙和短寿命。填料床必须有足够的密度以承受使用过程中遇到的流体压缩力。随着色谱柱直径的增加，要达到稳定的、长期的性能所需的床层密度越来越难。通过采用OBD™专利技术和填料工艺，我们可以为每种颗粒类型和几何形状的柱子进行填料，在整个柱子的长度上具有可预测的、均匀的密度。没有不可预知的和过早的空洞或失败。
  • 扩展性差。即使制备柱使用与分析柱相同的颗粒和化学成分，由于床层密度的不同，也不一定能保证良好的可扩展性。Waters OBD制备柱的设计使制备规模的床密度与分析规模的床密度一致。通过一系列可扩展的颗粒，我们可以帮助确保方法在第一次和每次都能正确扩展。
  • 不可复制性和供应。 沃特世拥有我们主要色谱柱原材料之后的整个供应和制造链。这为整个色谱柱的制造过程提供了强有力的工艺质量控制。
    • 我们经常用原材料生产小批量的介质
    • 我们设计、加工和组装我们自己的柱子
    • 我们自己打包的专栏

这也减少了我们不可预见的供应链中断的风险。如果这些中断发生了，它使我们能够迅速调整库存。作为你的合作伙伴，当我们烧掉我们的供应和质量风险时，你也会烧掉。我们能保证在任何时候任何栏目的库存或快速周转吗？不，当然不能。但我们是否为你设置了减轻供应链风险的措施？我想是的。

我们努力在需求最迫切的时候为您提供质量和性能稳定的产品。

立即注册参加我们的COVID-19焦点系列网络研讨会（2021年3月31日美国东部时间上午10点）--Martin Gilar将探讨寡核苷酸的离子对反相色谱，包括PCR探针的纯化。

 

 

其他信息和资源。

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