数据的完整性很重要。未知的、未整合的或未检测到的色谱峰

2020年3月24日

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在之前的一篇博客中，我讨论了对可能出现在液相色谱分离中的外来峰的担忧。虽然可能有很多与测试物质无关的峰的来源，但你如何决定哪些是合法的，哪些是质量差的表现？哪些是无害的，哪些是危险的？哪些是预期的，哪些是来自污染或制造过程中的变化？本博客将考虑可能存在于您的产品中，但在您的分析中没有显示的杂质。

一些LC基础科学。

首先，让我用几条注意事项来说明问题。大多数质控液相色谱分离使用紫外检测器，设置为一个特定的波长进行检测。在方法的开发和验证过程中，该波长设置的适用性要进行特异性优化，即确保在该设置下能检测到感兴趣的化合物，在适当的低水平上检测到有关分析物的反应，并且所选择的波长是一个稳定的选择。最后一点很重要，因为它可以保持方法检测你感兴趣的化合物的能力，即使在不同的液相色谱仪上的检测器之间可能出现紫外线波长的微小变化。这是否意味着所有可能的杂质、污染或降解产物都能在液相紫外法中被识别出来？当然不是!许多种类的污染物在任何LC测试中都可能被遗漏。

a) 在样品制备中未被提取的污染物

b) 没有紫外线吸收能力的污染物（例如，大多数聚合物、脂类甚至糖类都不能通过紫外线检测得到。

c) 污染物确实在紫外线下吸收，但其波长与测量样品主要成分的波长不同。

需要注意的是，色谱图上没有多余的峰并不能保证样品中没有意外的化学物质，只是说明该方法没有检测到任何不正常的东西。

搜索污染物

然而其他形式的检测可以帮助探测样品中的意外成分。

多年来，使用多种不同的波长已被证明对识别LC样品中的额外物质很有用。这些可以用于两个目的。寻找其他紫外线波长的色谱峰，以及检查一个峰内紫外线光谱的一致性。在一个色谱峰的整个洗脱过程中进行光谱分析，使科学家能够搜索具有不同紫外光谱的额外成分，与主要化合物同时洗脱，这被称为 "共洗"。在其最简单的形式中，一个多波长检测器可能监测4个不同的波长。如果对一个峰的读数进行比对，一个光谱均匀的单组分峰将产生一个直线比对，没有额外的紫外线吸收杂质造成的光谱干扰。这种估计 "峰值纯度 "的技术发展到利用光电二极管阵列检测器的 "所有波长"，允许软件识别任何在光谱上不同的紫外吸收杂质，并在测量峰值下共存。

然而，通过光谱同质性测量的峰纯度只能检测出吸收紫外光的污染物，对于共混杂质，它的紫外光谱必须与主峰有足够大的差异才能被发现。光谱峰纯度不能用来准确地定量杂质，但可以作为一个有用的指示，说明在同一保留时间内存在着非光谱均匀的共混成分。真正的定量需要将杂质峰与其他成分很好地分开，并且可以使用该特定污染物的标准品或化学性质非常相似的标准品来校准反应。

通用检测器

有一些检测器不依赖于被测分子的紫外吸收特性，而是对色谱柱流出物中除流动相以外的任何成分作出反应。(1) 这些检测器在检测污染物或在方法开发过程中评估基于紫外线的方法的完整性时很有用。然而，像折射率检测器（广泛用于糖类和聚合物的定量）这样的检测器的灵敏度几乎不足以检测大多数药物测试所需的水平。其他通用的检测器包括电导率检测器和基于气溶胶的检测器蒸发光散射检测器和带电气溶胶检测。

作为一种检测工具，MS也可以说是通用的，因为每个分子都有质量，但并不是所有的分子都能以MS所要求的气态形式带电，这意味着污染物仍然可能被遗漏。此外，与紫外检测相比，质谱检测一般采用更集中的模式。

质谱检测器将被 "调整 "以测量非常具体的质量的产物或子离子，进行极有选择性的测量，这在测量复杂的混合物时非常有利。

这种集中的质谱检测只有在你知道你在寻找什么污染物并为检测这些已知的污染物配置质谱时才有用。只有当分析员收集了大量的质量范围内的数据时，质谱检测才能达到 "捕捞 "污染物的能力，所有这些都需要详细审查。

正交检测

光电二极管阵列和质谱检测（或任何其他不同的正交检测器）可以帮助开发和质量控制实验室扫描分离的成分，并在与主要方法配置不同的参数设置下搜索紫外或质谱峰。同时收集紫外和质谱光谱可以帮助。

a) 确保不存在与所关注的主要化合物具有类似化学性质的污染物，并且

b) 为化学家提供更多关于色谱图中出现的不相干峰的识别信息。

对于那些来自于系统、或来自于样品制备、或出现在空白进样中的峰（即我们在上一篇博客中讨论的那些可以也应该被分析员忽略的峰），紫外光谱或质谱可以为正确识别峰的来源提供信心。同样，如果光谱信息不寻常或与我们期望看到的成分不匹配，那么来自这些检测器的结构性附加信息可以帮助解决这种污染物的身份和来源。然而，如前所述，重要的是要记住，有些化合物可能连质谱检测器都看不到。

总结

了解色谱检测的局限性对于理解对药物产品中的杂质的关注非常重要，特别是以前在工艺验证和配方研究中没有被识别和表征的未知或意外杂质。

随着检测能力的提高，无论是由于分离技术提供的更好的灵敏度，还是由于检测技术的提高，以前未曾见过的杂质的出现都是一个巨大的挑战。新的或更高的杂质水平可能会造成额外的分析工作和安全评估的监管负担，所有这些都需要传达给卫生当局。然而，因为担心这种发现而故意不修改和改进分析方法，并不能为病人的安全服务。遗憾的是，在当今受监管的企业中，推进和改进分析方法有时被视为一种不必要的愿望，特别是当现有的、传统的分析方法早些时候已经 "通过 "了药品监管机构的审核。

然而，目前的方法生命周期管理计划，以及为生命开发高质量的分析方法，为持续评估方法的性能提供了指导，并开启了一个监管框架，分析方法，像制造过程一样，可以得到改善，同时减少了因改变验证方法而产生的监管文件和注册负担。请参阅我们的方法生命周期管理（MLCM）网站以了解更多信息。

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