Da biopharmazeutische Unternehmen den Einsatz von Bio-Konjugaten und ADC als eine Art von Krebstherapie erproben, stellt die Analyse ihrer komplexen, unterschiedlichen Strukturen eine große Herausforderungen dar. Waters bietet Lösungen für diese speziellen analytischen Herausforderungen, indem es die Bewertung vieler wichtiger kritischer Qualitätsattribute (CQAs) erleichtert, einschließlich der Bestimmung von Wirkstoff-Antikörper-Verhältnissen (DAR) selbst bei niedrigen Mengen, unter anderem mithilfe von Umkehrphasen- (RP) oder hydrophober Interaktionschromatographie-Säulen (HIC), Aggregation und Fragmentierung mithilfe von Größenausschlusschromatographie-Säulen (SEC) und Konjugationsstellen mit PeptideWorks Kits für den Trypsinverdau für das Peptid-Mapping.
Unser umfassendes Säulenangebot umfasst:
Ganz gleich, ob Sie lysin-konjugierte ADCs analysieren und sekundäre Wechselwirkungen zwischen ADCs und Säulenhardware minimieren möchten oder andere Probleme mit der Datenqualität lösen möchten – Waters hat die richtige Säulentechnologie zur konsistenten und zuverlässigen Durchführung Ihrer Trennung von Biomolekülen.
Mit den Waters MaxPeak Premier Säulen haben Wissenschaftler dank der Verwendung von MaxPeak High Performance Surfaces (HPS) Technologie eine bessere Kontrolle über ihre chromatographischen Trennungen. Wenn beispielsweise eine Trennung von Proteinen nach Größe in Lösung erfolgt, können sekundäre Wechselwirkungen auftreten, die Probenverlust, breitere Peaks und ungenaue Quantifizierung von Aggregaten verursachen. Die MaxPeak High Performance Surface Technologie wurde unter Verwendung von Ethylen Bridged Hybrid (BEH) SEC-Partikeln mit hydroxy-terminiertem Polyethylenoxid (PEO) mit hoher Abdeckung entwickelt. Diese sind für genauere Daten äußerst bioinert. Dadurch werden hydrophobe Wechselwirkungen minimiert, die sekundäre Wechselwirkungen verursachen, was eine herausragende Peakform und konsistente Quantifizierung liefert.
Erhalten Sie die erwartete chromatographische Leistung, Flexibilität und Sicherheit der bewährten Partikeltechnologie von Waters mit Säulen, die in Partikelgrößen von 1,7 µm (ACQUITY Premier Säulen), 2,5 µm (XBridge Premier Säulen, XSelect Premier Säulen) und ≤ 3 µm (ausgewählten BioResolve Premier Säulen) erhältlich sind.
Umkehrphasen-Säulen für Bio-Konjugate und Antikörper-Wirkstoff-Konjugate mit MaxPeak HPS, wie die ACQUITY und XBridge Premier Protein BEH C4 Säulen, wurden speziell zur Minimierung sekundärer Wechselwirkungen zwischen ADCs und Säulenhardware entwickelt. Sie eignen sich für die Analyse von lysin-konjugierten ADCs. Im Gegensatz zu cystein-konjugierten ADC sind die Disulfidbrücken innerhalb der Ketten, die die Verknüpfungen zwischen den schweren und leichten Ketten des mAb für die lysin-konjugierten ADCs aufrechterhalten, intakt. Daher ist die Umkehrphasenchromatographie für die Analyse von lysin-konjugierten ADCs geeignet, wenn die Linker-Chemie bei einem sauren pH-Wert nicht instabil ist. Darüber hinaus bietet Waters Umkehrphasen-Säulen mit Solid Core Partikel-Technologie an, wie z. B. BioResolve RP mAb Polyphenyl für die Analyse auf Intaktheit und Untereinheiten, um die Lokalisierung verknüpfter Wirkstoffe auf Domänenebene zu bestimmen.
Waters Protein-Pak Hi Res HIC-Säulen mit nicht porösen Partikeln enthalten eine niedrige Dichte an Butyl-Liganden für eine hervorragende Auflösung in kürzerer Zeit im Vergleich zur Verwendung vieler traditioneller poröser HIC-Säulen. Dies gewährleistet eine konsistente Leistung von Charge zu Charge durch Qualitätskontrollprüfung mit definierten Proteinstandards.
Vermeiden Sie die Erstellung mehrerer mobiler SEC-Eluentenphasen mit verschiedenen Proteinen, indem Sie eine Plattformmethode mit phosphatgepufferter Salzlösung (d. h. PBS) für durchweg genaue Aggregat-, Monomer- und Fragmentdaten mit Waters SEC-Säulen verwenden. Darüber hinaus ist für Bio-Konjugate, die hydrophob sein können, was zu unerwünschten sekundären Wechselwirkungen führt, bei den MaxPeak Premier Protein SEC-Säulen und den PEO-gebundenen BEH-Partikeln kein organisches Lösungsmittel erforderlich.
Messen Sie Profile von Ladungsvarianten von cystein- und lysin-gebundenen ADCs mit der BioResolve SCX mAb Säule und den BioResolve CX pH-Pufferkonzentraten für Salz- oder pH-Gradienten mit minimalen sekundären Wechselwirkungen bei der optischen Detektion. Für strukturelle Erkenntnisse mit Massenspektrometrie beim Ionenaustausch machen unsere MS-kompatiblen Puffer, IonHance CX-MS pH-Pufferkonzentrate, die Online-IEX-MS mit hochreinen, flüchtigen, für die Massenspektrometrie geeigneten Puffern möglich.
Antikörper-Oligonukleotid-Konjugate (AOCs) werden häufig in der Proteindiagnostik eingesetzt und sind ein erfolgsversprechendes Thema für die gezielte Zelltherapie. Die negative Nettoladung eines AOC dehnt sich mit jeder zusätzlichen Konjugationsstelle aus, was zu einer erhöhten Retention auf einem Anionenaustauscherharz führt. Die GenPak FAX Säule enthält einen schwachen Anionenaustauscher, der eine kontrollierte Retention und eine einzigartige Selektivität für Protein und Oligonukleotidproben aufweist. Neue Applikationsarbeiten zeigen, dass AEX mit MALS gekoppelt werden kann, um absolute Molekulargewichtsinformationen zu erzeugen.
Hydrophile Interaktionschromatographie (HILIC) wurde häufig zur Trennung kleiner polarer Verbindungen genutzt, aber ihre Applikation auf große Biomoleküle war, abgesehen von freigesetzten Glykanen, überraschend begrenzt. Mit Waters weitporigen Glykoprotein-Säulen ist es jetzt möglich, mit HILIC bisher unerreichbare Informationen aus intakten Proteinen (mit oder ohne Glykosylierung), Proteinfragmenten und komplexen, freigesetzten Glykanen zu erhalten.
Dekonvolierte intakte Massenspektren für cystein-konjugierte ADCs aus nativen SEC-LC-MS nach Deglykosylierung. Die Wirkstoffverteilung wurde für drei verschiedene cystein-konjugierte ADC-Proben mit zunehmender Wirkstofflast verglichen.
Das Ladungsvariantenprofil eines eingestellten, cystein-gebundenen Antikörper-Wirkstoff-Konjugats von Pfizer wurde mit Ionenaustauschchromatographie erzielt. (A) UV-Chromatogramme, die mit einer Salz-Gradientenmethode von 20 mM MES (pH-Wert 5,4) und einer linearen Erhöhung der Natriumchlorid-Konzentration von 140–220 mM in 30 Minuten bei 0,80 mL/min mit einer BioResolve SCX mAb, 4,6 x 100 mm Säule erzielt wurden. UV-Chromatogramme, die mit pH-Gradientenmethoden mit einer BioResolve SCX mAb, 4,6 x 50 mm Säule mit BioResolve CX pH-Konzentraten und mobilen Phasen ohne (B), mit 5 % (C) oder mit 10 % Acetonitril (D) und einer linearen Steigerung des Prozentsatzes der mobilen Phase B von 0 auf 100 % in 30 Minuten bei 1,00 mL/min erzielt wurden. (E) Überlagerung von UV-Chromatogrammen, die mit pH-Gradientenmethoden mit einer BioResolve SCX mAb Säule mit 4,6 x 50 mm unter Verwendung von BioResolve CX pH-Konzentraten und mobilen Phasen ohne, mit 5 % und mit 10 % Acetonitril erzielt wurde. Die UV-Detektion erfolgte bei 280 nm.
Hydrophile Interaktionschromatographie eines mAb im Vergleich zu seinem ADC. Die Zahlen geben an, wie viele Linker/Nutzlasten im Konjugat vorhanden sind, wobei a und b Stellungsisomere angeben. *Bezeichnet Linker-/Nutzlast-Hydrolyseprodukte. #Bezeichnet eine Spurenoxidation. Die Glykosylierung wird entsprechend der Cambridge-Nomenklatur gekennzeichnet. F steht für Fucose, A2 stellt dar, dass die Strukturen zwei Antennen haben, und G steht für Galactose (FA2 = G0F, FA2G1 = G1F und FA2G2 = G2F).
AEX-MALS einer AOC-Probe, erhalten mit einer Waters Gen-Pak FAX Säule. Es wird ein UV-280-nm-Chromatogramm mit überlagerter Molmasse angezeigt. Peakbegrenzungen werden durch die vertikalen gestrichelten Linien angezeigt.
Vergleich des Peptide-Mappings (UV-Chromatogramme) von konjugiertem und nicht konjugiertem Trastuzumab
Vergleich der Leistung bei hydrophoben sekundären Wechselwirkungen mit dem ADC Ado-Trastuzumab Emtansin. Bei Erhöhung der organischen Konzentration ist der Grad der Veränderung bei der XBridge Premier Protein SEC 250 Å, 2,5 µm Säule wiederum vernachlässigbar, mit einer hervorragenden Peakform von 0 bis 15 % MeCN. Hydrophobe sekundäre Wechselwirkungen wurden durch die Verwendung von hydroxy-terminiertem PEO-Packungsmaterial mit hoher Abdeckung stark gemildert.
Cystein-konjugierte ADC-Analyse mithilfe von HIC. Die Wirkstoffverteilung wurde für drei verschiedene cystein-konjugierte ADC-Proben mit zunehmender Wirkstofflast bestimmt.
