Trennmethoden
Identifizieren von Chemien, die all Ihre chromatographischen Herausforderungen erfüllen
Reversed-Phase-Chromatographie
Die Umkehrphasenchromatographie (auch: Reversed-Phase-Chromatographie) ist die heute bei weitem am häufigsten im Labor angewendete Trenntechnik in der Flüssigchromatographie, und ihre Popularität spiegelt sich in der großen Auswahl an Säulenprodukten wieder, die Waters für diese Technik anbietet.
In ihrer einfachsten Form besteht die Umkehrphasenchromatographie aus einer polaren mobilen Phase, meist Mischungen von Wasser oder einem Puffer mit polaren Lösungsmitteln wie Methanol, Acetonitril oder Tetrahydrofuran, und einer unpolaren stationären Phase wie zum Beispiel einem langkettigen Kohlenwasserstoff, der an eine Silika- oder Hybridbasis gebunden ist. In den letzten Jahren wurde erhebliche Forschungs- und Entwicklungsarbeiten im Bereich der Trennmedien geleistet, um Säuleneffizienz und pH-Stabilität zu verbessern und neue Selektivitäten anzubieten.
Die aktuellen Säulenmaterialien von Waters können grob in drei Kategorien eingeteilt werden:
- Hybrid: maximale pH-Stabilität für höchste Flexibilität bei der Methodenentwicklung. Erhältlich unter den Markennamen XBridge, ACQUITY BEH und XTerra; pH-Bereich 1 – 12.
- Silika: Die SunFire und Symmetry Produkte waren früher die meistgenutzten Produkte in der Umkehrphasenchromatographie. Sie werden im Waters Produktionsbetrieb in Taunton (USA) aus Rohmaterialien hergestellt und sind auf maximale Beladbarkeit ausgelegt; pH-Bereich 2 – 7.
- Applikationsspezifisch: für spezielle Applikationen, zum Beispiel die Atlantis Säulen zur besseren Retention polarer Moleküle
Normalphasenchromatographie
Vor der Entwicklung der Umkehrphasen war die Normalphasenchromatographie die verbreitetste Trennmethode. Hierbei wird die Wechselwirkung von Analyten mit polaren funktionellen Gruppen auf der Oberfläche der stationären Phase ausgenutzt. Diese Wechselwirkung ist bei Nutzung von unpolaren Lösungsmitteln als mobile Phase am stärksten.
Die Normalphasenchromatographie ist eine sehr leistungsfähige Trennmethode, da eine große Auswahl von Lösungsmitteln verwendet werden kann, um die Selektivität einer Trennung genau abzustimmen. Aufgrund ihrer Komplexität hat sie allerdings bei vielen Chromatographieanwendern an Beliebtheit verloren. Unter bestimmten Bedingungen können lange Äquilibrierungszeiten oder Probleme mit der Reproduzierbarkeit auftreten, deren Hauptgrund die Empfindlichkeit der Technik gegenüber niedrigen Konzentrationen polarer Kontaminanten in der mobilen Phase ist. Wenn diese Probleme beherrscht werden, liefert die Technik normalerweise bessere Chromatogramme als Umkehrphasen-Methoden, da die üblicherweise verwendeten Lösungsmittel eine niedrigere Viskosität aufweisen.
Normalphasensäulen sind in den Produktfamilien SunFire, Nova-Pak und Spherisorb erhältlich.
HILIC (Hydrophile Interaktionschromatographie)
Die hydrophile Interaktionschromatographie wird schon seit langem angewendet, wobei die Bezeichnung HILIC erst seit kurzem gebräuchlich ist. Analyten sind sehr polare Verbindungen, wie zum Beispiel polare Metaboliten, Kohlenhydrate oder Peptide.
HILIC kann als eine Erweiterung der Normalphasenchromatographie im Bereich der wässrigen mobilen Phasen betrachtet werden. Die mobilen Phasen sind Mischungen aus Wasser oder Puffer (< 40 %) mit organischen Lösungsmitteln. Die stationären Phasen sind sehr hydrophile polare Adsorbentien wie Silika, polare gebundene Phasen, polare polymere Packungsmaterialien und Ionenaustauscher. Der gemeinsame Faktor aller dieser stationären Phasen ist, dass sie leicht Wasser adsorbieren können, daher die Kategorisierung als „hydrophil“.
Die bei der HILIC-Technik verwendeten Gradientenmethoden sind genau das Gegenteil der Methoden, die bei der Umkehrphasentechnik eingesetzt werden. Die Anfangsbedingungen bestehen aus einem hohen organischen Anteil, typischerweise 95 %, und bewegen sich dann progressiv zu einem höheren Anteil an wässrigem Lösungsmittel. Aus diesem Grund wird auch der Ausdruck „reversed-reversed-phase“ (umgekehrte Umkehrphase) benutzt.
Die Technik wird immer beliebter, und ist daher das Thema intensiverer Forschungen zu Säulenpackungsmaterialien.
Die HILIC-Säulen von Waters sind zur Zeit in den Produktfamilien Atlantis, CORTECS, XBridge und ACQUITY erhältlich.
Reversed-Phase-Chromatographie
Die Umkehrphasenchromatographie (auch: Reversed-Phase-Chromatographie) ist die heute bei weitem am häufigsten im Labor angewendete Separationstechnik in der Flüssigchromatographie, und ihre Popularität spiegelt sich in der großen Auswahl an Säulenprodukten wieder, die Waters für diese Technik anbietet.
Die Reversed-Phase-Chromatographie umfasst eine polare mobile Phase, in der Regel Gemische aus Wasser oder gepuffertem Wasser, gemischt mit unpolareren Lösungsmitteln wie Methanol, Acetonitril oder Tetrahydrofuran. Die stationäre Phase ist unpolar und wird in einigen Fällen durch die Verbindung einer langkettigen Kohlenwasserstofffunktion mit einem Silika-, Solid-Core-, Polymer- oder Hybridpartikelträger erzeugt. In den letzten Jahren wurde erhebliche Forschungs- und Entwicklungsarbeit im Bereich der Medien für Umkehrphasentrennungen geleistet, um die Säuleneffizienz und pH-Stabilität zu verbessern und neue Selektivitäten anzubieten.
Die aktuellen Säulenmaterialien von Waters können grob in vier Kategorien eingeteilt werden:
- Hybrid: höchste pH-Stabilität für höchste Flexibilität bei der Methodenentwicklung. pH-Bereich von 1 bis 12.
- Silika: Diese Produkte waren früher die meistgenutzten Produkte in der Umkehrphasenchromatographie. Sie werden im Waters Produktionsbetrieb in Taunton (USA) aus Rohmaterialien hergestellt und sind auf maximale Beladbarkeit ausgelegt. pH-Bereich von 2 bis 7.
- Solid-Core – Partikel zur Maximierung der Säuleneffizienz durch Verringerung der additiven Quellen der Säulendispersion. Verfügbar in Partikelgrößen von 1,6 und 2,7 µm und kompatibel mit allen LC-Systemen.
- Applikationsspezifisch: entwickelt für einen speziellen Applikationsbereich, um eine bessere Retention polarer Moleküle zu erreichen.
Verwandte Säulenmarken
Hybrid
Silika
Solid-Core
Applikationsspezifisch
Normalphasenchromatographie
Die Normalphasenchromatographie kann man sich als das Gegenteil der Umkehrphasenchromatographie vorstellen. Sie beruht auf der Wechselwirkung von Analyten mit polaren funktionellen Gruppen mit der polaren Oberfläche der stationären Phase. Die stark eluierende mobile Phase für die Normalphasenchromatographie ist polar, sodass eine maximale Retention durch die Verwendung unpolarer Lösungsmittel erreicht wird.
Die Normalphasenchromatographie ist eine sehr leistungsfähige Trennmethode, da eine große Auswahl von Lösungsmitteln verwendet werden kann, um die Selektivität einer Trennung genau abzustimmen. Aufgrund ihrer Komplexität hat sie allerdings bei vielen Chromatographieanwendern an Beliebtheit verloren. Unter bestimmten Bedingungen können lange Äquilibrierungszeiten oder Probleme mit der Reproduzierbarkeit auftreten, deren Hauptgrund die Empfindlichkeit der Technik gegenüber niedrigen Konzentrationen polarer Kontaminanten in der mobilen Phase ist. Wenn diese Probleme beherrscht werden, liefert die Technik normalerweise bessere Chromatogramme als Umkehrphasen-Methoden, da die üblicherweise verwendeten Lösungsmittel eine niedrigere Viskosität aufweisen.
Verwandte Säulenmarken
HILIC (Hydrophile Interaktionschromatographie)
Die hydrophile Interaktionschromatographie wird schon seit Langem angewendet, wobei die Bezeichnung HILIC erst seit Kurzem gebräuchlich ist. HILIC ist eine Variante der Normalphasenchromatographie, bei der sehr polare Verbindungen wie polare Metaboliten, Kohlenhydrate oder Peptide am besten zurückgehalten werden.
Die mobilen Phasen sind Mischungen aus Wasser oder Puffer (< 40 %) mit organischen Lösungsmitteln. Die stationären Phasen sind sehr hydrophil und bestehen aus Silika, polaren gebundenen Phasen, polaren polymeren Packungsmaterialien, Zwitterionen und Ionenaustauschern. Der gemeinsame Faktor all dieser stationären Phasen ist, dass sie leicht eine Wasserschicht auf der Partikeloberfläche adsorbieren können, um die Trennung zu vereinfachen. Es ist die Trennung von der später an der Oberfläche immobilisierten Wasserschicht und der mobilen Phase, die die Retention fördert. Die bei der HILIC-Technik verwendeten Gradientenmethoden sind genau das Gegenteil der Methoden, die bei der Umkehrphasentechnik eingesetzt werden. Die Anfangsbedingungen bestehen aus einem hohen organischen Anteil, typischerweise 95 %, und bewegen sich dann progressiv zu einem höheren Anteil an wässrigem Lösungsmittel. Aus diesem Grund wird auch der Ausdruck „reversed-reversed-phase“ (umgekehrte Umkehrphase) benutzt.
Die Technik wird immer beliebter, und ist daher das Thema intensiverer Forschungen zu Säulenpackungsmaterialien.
Verwandte Säulenmarken
Ionenaustauschchromatographie
Ionenaustauschtrennungen werden meistens mit Salz oder pH-Gradienten gefahren, wobei weniger geladene Proteine früher eluieren als höher geladene Moleküle. Je nach Proteintyp und pH-Wert der Trennung werden entweder Anionen- oder Kationenaustauscher für die Trennung eingesetzt. Darüber hinaus spielen die Gradientendauer, die Pufferzusammensetzung, der pH-Wert, die Flussrate und die Temperatur eine wichtige Rolle für eine erfolgreiche Trennung von Proteinen.
