Colunas e padrões de AEX para terapias genéticas

Colunas e padrões de AEX para terapias genéticas

Desenvolva métodos baseados em carga para uma variedade de terapias genéticas. As colunas de AEX da Waters proporcionam retenção e seletividade versáteis para desenvolvedores de medicamentos concentrados em oligonucleotídeos sintéticos, edição genética de CRISPR (Repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), mRNA, DNA de plasmídeo e vetores virais.

Desenvolva métodos baseados em carga para uma variedade de terapias genéticas. As colunas de AEX da Waters proporcionam retenção e seletividade versáteis para desenvolvedores de medicamentos concentrados em oligonucleotídeos sintéticos, edição genética de CRISPR (Repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), mRNA, DNA de plasmídeo e vetores virais.
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Visão geral

A AEX é uma técnica fundamental para a separação da terapia genética, incluindo oligonucleotídeos antissentido, siRNA, RNA guia único (sgRNA, Single Guide RNA) de CRISPR (Repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), complexos de ribonucleoproteína, mRNA, plasmídeos de DNA e capsídeos virais. O mecanismo de troca aniônica é baseado em interações eletrostáticas entre analitos com carga negativa e a fase estacionária com carga positiva. Quanto mais fortemente negativa for uma biomolécula, mais firmemente ela adsorverá à resina da coluna. Os analitos separam e eluem com base na densidade de carga à medida que a força iônica ou o pH de fase móvel sofrem mudanças.

Garanta condições ideais para sua análise escolhendo o melhor padrão e coluna de AEX da Waters para sua rotina de trabalho.

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Colunas de troca aniônica fraca para separações aprimoradas

Colunas de troca aniônica fraca para separações aprimoradas

As Colunas Waters Gen-Pak FAX de 4,6 x 100 mm oferecem a mais alta resolução disponível em HPLC de troca aniônica de ácidos nucleicos. A Coluna Gen-Pak FAX contém um trocador aniônico fraco baseado em resina não porosa funcionalizada DEAE-C (Dietilaminoetil celulose). Ela contém partículas de 2,5 μm e é ideal para aplicações analíticas e de micropreparação.

  • Colunas de polímero não poroso de troca aniônica fraca
  • Separação de alta resolução de oligonucleotídeos sintéticos e ácidos nucleicos
  • Seletividade única de DEAE e baixa capacidade de retenção necessárias para aplicações específicas

Colunas de troca aniônica forte para resolução excepcional em menos tempo

Colunas de troca aniônica forte para resolução excepcional em menos tempo

A Coluna de troca iônica (IEX, Ion-Exchange) Waters Protein-Pak Hi Res Q de 4,6 x 100 mm auxilia na caracterização de proteínas recombinantes, anticorpos monoclonais e outros compostos biológicos. A elevada capacidade de ligação de compostos não porosos dessas partículas gera uma excelente resolução de espécies carregadas em menos tempo quando comparada à utilização de muitas ofertas porosas tradicionais de IEX.

  • Colunas preenchidas com polímero não poroso de troca aniônica forte
  • Alta capacidade de ligação com uma funcionalidade de ligante de amina quaternária
  • Compatível com várias biomoléculas

Webinar: Novas percepções sobre troca aniônica e exclusão por tamanho de ácidos nucleicos

Desenvolvimento de novos métodos de AEX e SEC para separações de mRNA e AAV

O sucesso das vacinas de mRNA demonstra as capacidades dos medicamentos à base de ácidos nucleicos. São necessárias mais ferramentas de caracterização analítica para fornecer mais informações sobre estabilidade, heterogeneidade, formulação de medicamentos e relações estrutura-função. As técnicas de cromatografia de exclusão por tamanho (SEC, Size-Exclusion Chromatography) e de AEX (Anion-Exchange, troca aniônica) são ideais para fornecer separações de alta resolução de ácidos nucleicos e seus carregadores. Este webinar explora um método de plataforma mais robusto para várias substâncias de medicamentos e tipos de amostra, incluindo AAVs e mRNA.

Desenvolvimento de novos métodos de AEX e SEC para separações de mRNA e AAV

O sucesso das vacinas de mRNA demonstra as capacidades dos medicamentos à base de ácidos nucleicos. São necessárias mais ferramentas de caracterização analítica para fornecer mais informações sobre estabilidade, heterogeneidade, formulação de medicamentos e relações estrutura-função. As técnicas de cromatografia de exclusão por tamanho (SEC, Size-Exclusion Chromatography) e de AEX (Anion-Exchange, troca aniônica) são ideais para fornecer separações de alta resolução de ácidos nucleicos e seus carregadores. Este webinar explora um método de plataforma mais robusto para várias substâncias de medicamentos e tipos de amostra, incluindo AAVs e mRNA.

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Soluções

WAX ligada, WAX desligada

WAX ligada, WAX desligada
Colunas Gen-Pak FAX

Sob condições nativas, os oligonucleotídeos e ácidos nucleicos mais longos carregam uma estrutura de fosfato polianiônico com carga negativa. Essa funcionalidade torna os ácidos nucleicos candidatos ideais para AEX. A Coluna Waters Gen-Pak FAX é uma resina de troca aniônica fraca não porosa de 2,5 µm desenvolvida para ácidos nucleicos que variam de oligonucleotídeos sintéticos a mRNA.

  • Synthetic Oligonucleotide Separations
  • Oligonucleotide Anion Exchange Separations
  • Empty/Full Viral Capsid Analysis

SAX até o MAX

SAX até o MAX
Colunas Protein-Pak Hi Res Q

A Coluna Protein-Pak Hi Res Q contém uma resina polimérica não porosa com funcionalidade de amina quaternária. Suas aplicações de troca catiônica/aniônica forte (SAX, Strong Anion Exchange) são múltiplas e de grande alcance, incluindo análise de integridade de mRNA, formação de complexos de ribonucleoproteínas e RNA guia único (sgRNA, Single Guide RNA) de CRISPR (Repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente espaçadas), quantificação de isoformas de DNA de plasmídeos e análise de encapsidação vazia/completa de terapias genéticas com vetores virais. 

  • Oligonucleotide Anion Exchange Separations
  • Intact mRNA Analysis
  • Evaluating CRISPR Guide RNA and Ribonucleoprotein Complex Formation
  • Empty/Full Viral Capsid Analysis

Padrões de oligonucleotídeos e ácidos nucleicos para referência de AEX

Padrões de oligonucleotídeos e ácidos nucleicos para referência de AEX
Padrões de ácidos nucleicos e oligonucleotídeos

Os métodos de AEX são uma ferramenta poderosa para a caracterização e confirmação da qualidade das terapias genéticas. Dispor de materiais de referência de qualidade que sejam quimicamente semelhantes aos seus analitos pode ajudar a acelerar o desenvolvimento de métodos e fornecer uma referência certificada para ensaios futuros.

  • Lipid conjugated ASO
  • siRNA oligonucleotides
  • Single-Guide RNA (sgRNA)
  • DNA Ladder
  • Empty/Full Viral Capsid Analysis

Aplicações

Há muitos exemplos da resina de troca aniônica fraca Gen Pak FAX que demonstram um poder de resolução superior, uma maior recuperação e uma seletividade única para proteínas, oligonucleotídeos e ácidos nucleicos. A menor capacidade de retenção da coluna permite o ajuste da fase móvel para melhorar a separação e alcançar uma seletividade única de separação de isoformas desaminadas por meio de uma condição de fase móvel desnaturante. 

Há muitos exemplos da resina de troca aniônica fraca Gen Pak FAX que demonstram um poder de resolução superior, uma maior recuperação e uma seletividade única para proteínas, oligonucleotídeos e ácidos nucleicos. A menor capacidade de retenção da coluna permite o ajuste da fase móvel para melhorar a separação e alcançar uma seletividade única de separação de isoformas desaminadas por meio de uma condição de fase móvel desnaturante. 

Notas de aplicação

A proteína Cas forma um complexo de ribonucleoproteína (RNP, Ribonucleoprotein) com sgRNA. É fundamental avaliar a eficiência e a força da complexação de RNP (Ribonucleoproteínas) durante o desenvolvimento de medicamentos. Também é importante testar a pureza das substâncias de medicamentos relacionadas. Uma nova abordagem destaca como esses três componentes podem ser prontamente separados com base na carga nativa pelo acoplamento da troca catiônica e aniônica. 

A proteína Cas forma um complexo de ribonucleoproteína (RNP, Ribonucleoprotein) com sgRNA. É fundamental avaliar a eficiência e a força da complexação de RNP (Ribonucleoproteínas) durante o desenvolvimento de medicamentos. Também é importante testar a pureza das substâncias de medicamentos relacionadas. Uma nova abordagem destaca como esses três componentes podem ser prontamente separados com base na carga nativa pelo acoplamento da troca catiônica e aniônica. 

Notas de aplicação

A AEX fornece uma medição direta para separar e quantificar isoformas de plasmídeo para testes de pureza. A AEX separa plasmídeos superenrolados (SC, Supercoiled), circulares abertos (OC, Open Circular) e lineares (L, Linear) com base em diferenças nas densidades de carga presentes na conformação desses plasmídeos. Por exemplo, o DNA superenrolado tem uma densidade de carga negativa maior do que a forma circular ou linear aberta mais frouxa, resultando em interação mais forte com a fase estacionária carregada positivamente da Coluna Protein-Pak Hi Res Q.

A AEX fornece uma medição direta para separar e quantificar isoformas de plasmídeo para testes de pureza. A AEX separa plasmídeos superenrolados (SC, Supercoiled), circulares abertos (OC, Open Circular) e lineares (L, Linear) com base em diferenças nas densidades de carga presentes na conformação desses plasmídeos. Por exemplo, o DNA superenrolado tem uma densidade de carga negativa maior do que a forma circular ou linear aberta mais frouxa, resultando em interação mais forte com a fase estacionária carregada positivamente da Coluna Protein-Pak Hi Res Q.

Notas de aplicação

O monitoramento da eficiência de encapsulamento da carga de DNA em um capsídeo viral, como uma terapia genética de AAV, é essencial durante a biofabricação. Uma alta porcentagem de capsídeos pode não conter o transgene desejado e nenhum benefício terapêutico correspondente. A troca aniônica pode separar funcionalmente capsídeos vazios e completos com base na carga negativa aumentada transmitida pelos transgenes presentes no interior do vetor. 

O monitoramento da eficiência de encapsulamento da carga de DNA em um capsídeo viral, como uma terapia genética de AAV, é essencial durante a biofabricação. Uma alta porcentagem de capsídeos pode não conter o transgene desejado e nenhum benefício terapêutico correspondente. A troca aniônica pode separar funcionalmente capsídeos vazios e completos com base na carga negativa aumentada transmitida pelos transgenes presentes no interior do vetor. 

Notas de aplicação

O renascimento do mRNA resultou em uma necessidade renovada de métodos analíticos sensíveis e robustos para caracterizar as propriedades biofísicas de candidatos a medicamentos e vacina de RNA. Para análise de mRNA intacto, um gradiente de sal de alquil amônio pode ser empregado a baixa temperatura para preservar a autoestrutura do mRNA, permitindo que a heterogeneidade seja avaliada juntamente com uma determinação rápida da concentração das amostras. Essas técnicas também podem ser otimizadas para monitorar o progresso de uma reação de transcrição in vitro.

O renascimento do mRNA resultou em uma necessidade renovada de métodos analíticos sensíveis e robustos para caracterizar as propriedades biofísicas de candidatos a medicamentos e vacina de RNA. Para análise de mRNA intacto, um gradiente de sal de alquil amônio pode ser empregado a baixa temperatura para preservar a autoestrutura do mRNA, permitindo que a heterogeneidade seja avaliada juntamente com uma determinação rápida da concentração das amostras. Essas técnicas também podem ser otimizadas para monitorar o progresso de uma reação de transcrição in vitro.

Notas de aplicação

Os dados falam por si

Os dados falam por si
Observou-se que o sgRNA está presente em quantidade um pouco excessiva após a formação de complexos com a proteína Cas9. A complexação foi monitorada em 260 (preto) e a 280 nm (vermelho).
Cromatogramas de UV (260 nm) obtidos para uma escada de oligo dT utilizando várias colunas de AEX. As separações de gradiente de sal foram realizadas a 30 °C com uma taxa de fluxo de 0,72 mL/min, fase móvel de tampão Tris de pH 8 com 20 mM e um gradiente de 10 minutos executado de 300 a 600 mM de NaCl.
Separação da isoforma do plasmídeo ΦX174 (L, O, SC) em uma Coluna Waters Protein-Pak Hi Res Q. Tampão Tris a 20 mM e pH 7,4, cloreto de tetrametilamônio de 1,69 a 1,75 M em 10 min. Taxa de fluxo: 0,4 mL/min.
Quantificação da % de capsídeo vazio em várias misturas de capsídeo vazios e completos utilizando o método de AEX otimizado. 
Separações de troca iônica de mRNA de Cas9 (A) e mRNA de EPO (B) utilizando uma coluna de AEX, uma fase móvel tamponada Tris e um gradiente de cloreto de sódio combinados com uma série de temperaturas de coluna diferentes entre 30 e 60 °C.
Separações de troca iônica de mRNA de Cas9 (A) e mRNA de EPO (B) utilizando uma coluna de AEX, uma fase móvel tamponada Tris e um gradiente de cloreto de sódio combinados com uma série de temperaturas de coluna diferentes entre 30 e 60 °C.

Webinars e recursos

  • How-to Video

Novas percepções sobre troca aniônica e exclusão por tamanho de ácidos nucleicos

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