Alterações do formato de pico ao longo do tempo

Conforme discutido nas três primeiras partes desta série, problemas relacionados ao formato de pico são comuns nas análises de HPLC. O ideal é que os picos sejam simétricos, com uma forma gaussiana [D. R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021) 353–362]. A simetria de um pico pode ser quantificada por meio do cálculo do fator de cauda (T) conforme a USP, como ilustrado na Figura 1. Um fator de cauda de 1 indica simetria perfeita, enquanto valores menores que 1 são denominados frontais, e valores maiores que 1 são denominados de cauda. Muitos métodos exigem que os fatores de cauda para todos os picos estejam dentro de um intervalo especificado. Os fatores de cauda que se desviam significativamente de 1 podem diminuir a resolução de picos que eluem próximos uns dos outros, tornando a integração mais difícil [D. R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021) 353–362]. Além disso, quando a simetria do pico é ruim, ele geralmente é mais largo do que deveria ser, o que diminui sua altura. Em aplicações que envolvam detecção e quantificação de analitos presentes em baixas concentrações, isso pode diminuir a precisão dos resultados, bem como os limites de quantificação e detecção.

Em muitas aplicações, um método é utilizado repetidamente para analisar um grupo de amostras. Para garantir que sejam obtidos resultados exatos, é importante que a coluna forneça larguras de pico e fatores de cauda consistentes para a duração do conjunto de análises. No entanto, isso nem sempre pode ser alcançado na prática. No exemplo mostrado na Figura 2, uma separação isocrática de quatro compostos mostra mudanças na largura do pico e na sua simetria após 100 injeções. Uma coluna de sílica C₁₈ foi utilizada com uma fase móvel contendo um tampão de fosfato de potássio de pH 7,0 e metanol (35:65 v/v) e uma temperatura de coluna de 40 °C. Conforme discutido nas três primeiras partes, há várias causas possíveis para alterações na simetria do pico, incluindo problemas com o sistema de HPLC, a fase móvel, a amostra e a coluna [J. W. Dolan e L. R. Snyder, Troubleshooting LC Systems, Springer Science+Business Media, New York, 1989, pp. 385-420]. Como discutido anteriormente, um bom ponto de partida para a solução de problemas é analisar cuidadosamente os cromatogramas para observar se a alteração no formato de pico é vista em todos os picos ou apenas em alguns deles. Nos cromatogramas mostrados na Figura 2, a maior alteração é observada para nortriptilina (pico 1), enquanto uma alteração menor é observada para amitriptilina (pico 4). Aumentos significativos no tempo de retenção também são evidentes para esses dois picos. Os outros dois picos (pico 2, 2-metilnaftaleno e pico 3, acenafteno) mostram mudanças menores. Notavelmente, a nortriptilina e a amitriptilina são compostos básicos, enquanto o 2-metilnaftaleno e o acenafteno não são ionizáveis. Quando apenas os picos de compostos básicos apresentam aumento nos tempos de retenção e de cauda, como na Figura 2B, as causas prováveis incluem uma alteração na fase móvel ou na coluna. Para determinar qual delas causava as alterações observadas no cromatograma da Figura 2B, a coluna foi substituída por uma nova do mesmo tipo. Utilizando a mesma fase móvel, foi obtido o cromatograma mostrado na Figura 2C. Esse cromatograma mostra uma separação similar à obtida inicialmente na coluna original, indicando que a causa do aumento da assimetria na injeção 100 era uma alteração na coluna.

Como a coluna foi utilizada dentro dos intervalos recomendados para temperatura (20 a 45 °C) e pH (2 a 8), essa deterioração relativamente rápida não era esperada. No entanto, é importante considerar que o pH do tampão aquoso muda quando o solvente orgânico (metanol) é adicionado. Foi relatado que a diluição de uma solução aquosa de fosfato a pH 7,05 com um volume igual de metanol fazia com que o pH aumentasse para 8,29 [I. Canals, J. A. Portal, E. Bosch, M. Roses, Anal. Chem. 72 (2000) 1802–1809]. Como a fase móvel utilizada para produzir os cromatogramas da Figura 2 continha 65% de metanol, era esperado que o pH da fase móvel fosse ainda mais alto e acima do limite recomendado de 8. Utilizar um pH de fase móvel acima do limite recomendado pode levar à hidrólise da fase estacionária, causando a perda de grupos ligados e a formação de silanóis adicionais, bem como uma perda de eficiência [J. J. Kirkland, M. A. van Straten, H. A. Claessens, J. Chromatogr. A 691 (1995) 3–19]. Esse é provavelmente o motivo para as alterações no formato de pico e na retenção vistas na Figura 2B.

Ao utilizar fases móveis com um pH superior a 8, uma escolha mais robusta do que uma coluna de sílica C₁₈ é uma coluna preenchida com partículas híbridas orgânicas/inorgânicas [K. D. Wyndham, J. E. O’Gara, T. H. Walter, K. H. Glose, N. L. Lawrence, B. A. Alden, G. S. Izzo, C. J. Hudalla, P. C. Iraneta, Anal. Chem. 75 (2003) 6781–6788]. Para demonstrar isso, o mesmo método foi utilizado com uma coluna de partículas híbridas (XBridge BEH C₁₈), fornecendo os resultados mostrados na Figura 3. Com a melhoria da estabilidade alcalina da coluna de partículas híbridas, não foram observadas alterações significativas no formato de pico ao longo de 120 injeções. Esses resultados mostram que as mudanças no formato de pico ao longo do tempo podem ser causadas pela hidrólise de fase ligada, especialmente quando uma coluna é utilizada perto de seus limites de temperatura e pH recomendados. É importante ressaltar que o efeito do solvente orgânico sobre o pH do tampão aquoso deve ser levado em conta ao verificar se o pH da fase móvel está dentro da faixa recomendada para a coluna.