RNases RapiZyme
Digestion modulable de l’ARN pour un séquençage LC/MS rationalisé
Pour confirmer l’identité, les séquences et la pureté de l’ARNsg et de l’ARNm CRISPR, il est nécessaire de procéder à une caractérisation rigoureuse. Ces molécules d’ARN se prêtent parfaitement à l’analyse par LC/MS en raison de leur fonctionnalité complexe, des modifications et des variants présents. Compte tenu de leur taille, on réalise souvent avant l’injection une digestion au moyen d’une endonucléase telle qu’une RNase. Les produits ainsi obtenus sont facilement détectables par chromatographie en phase inverse avec appariement d’ions (IPRP) ou par chromatographie hydrophile (HILIC) couplée à la spectrométrie de masse (MS).
Les enzymes RapiZyme MC1 et RapiZyme Cusativin de Waters permettent un clivage contrôlé et reproductible de l’ARN sur toute une série de sites dinucléotidiques. Les RNases RapiZyme produisent une variété de fragments d’ARN uniques qui se recoupent de façon complémentaire. Les utilisateurs de LC/MS bénéficient alors de digestions modulables qui améliorent la fiabilité de l’identification des pics, avec pour résultat une meilleure couverture des séquences et plus d’informations sur les molécules. Chaque tube contient 10 000 unités de RNase RapiZyme, soit suffisamment de réactif enzymatique pour réaliser 100 réactions de digestion d’échantillons d’ARN de 10 µg.
- Couverture maximale des séquences d’ARNm et d’ARNsg
- RNases spécifiquement conçues pour l’analyse LC/MS
- Plus besoin de dénaturants ni d’inhibiteurs de RNases lors de la digestion
- Signal plus clair et sensibilité accrue grâce aux produits à base de phosphate cyclique
- Développement et analyse accélérés des thérapies à base d’ARN
RNases RapiZyme
Spécifications
Présentation
- Obtenez de meilleurs résultats grâce à une couverture plus complète des séquences pour la caractérisation de l’ARN par LC/MS.
- Gagnez en efficacité grâce à des réactifs enzymatiques hautement actifs et de grande pureté, pour un maximum de 100 réactions selon le substrat.
- Simplifiez votre analyse grâce à un protocole de digestion prêt pour l’automatisation.
- Évitez la surdigestion et la contamination de l’instrument/de la colonne grâce à une inactivation thermique fiable qui ne nécessite aucun réactif inhibiteur supplémentaire.
- Ciblez les résidus uridine ou cytidine en utilisant deux spécificités enzymatiques.
- Maximisez la sensibilité et simplifiez l’interprétation des données grâce aux fonctions de digestion enzymatique intégrées dans waters_connect MAP Sequence.
- Utilisez l’additif de phase mobile IonHance HFIP pour diviser par deux les adduits de sodium et de potassium indésirables.
Utilisation recommandée : pour une meilleure couverture de séquence pour les produits thérapeutiques à base d’ARNsg et d’ARNm CRISPR.
Le défi de la digestion
Les réactifs RapiZyme MC1 et RapiZyme Cusativin ont des spécificités de clivage reproductibles. Pour les étudier, nous avons utilisé des substrats d’ARN à double marquage et désactivés. Lors du clivage par la RNase, un substrat d’essai marqué au FAM est séparé de son conjugué Black Hole Quencher. La digestion est ensuite détectée à l’aide de techniques basées sur l’absorbance, ce qui permet de quantifier le clivage sur cible. Un substrat de contrôle négatif, marqué au HEX (p. ex. polyA), est également utilisé pour évaluer le clivage hors cible. Le rapport FAM/HEX fournit des indications sur l’activité de chaque enzyme et peut être déterminé dans diverses conditions, notamment en termes de température, de pH, de composition du tampon, d’unités enzymatiques et de temps. Ces analyses ont été réalisées pour déterminer les conditions optimales de réaction pour les réactifs RapiZyme Cusativin et RapiZyme MC1.
La spécificité à l’œuvre
Les réactifs RapiZyme MC1 et RapiZyme Cusativin sont des RNases hautement actives et de grande pureté qui offrent des spécificités de clivage complémentaires. Ces enzymes recombinantes et modulables sont conçues pour accélérer le développement et l’analyse des produits thérapeutiques à base d’ARN en facilitant la digestion contrôlée des oligonucléotides synthétiques, de l’ARNm et de l’ARNsg. On observe une efficacité et une sélectivité de digestion optimales sur les liaisons dinucléotidiques [A/U/C]pU à pH 8 pour RapiZyme MC1 et sur les séquences dinucléotidiques Cp[U/A/G] à pH 9 pour RapiZyme Cusativin. Les paramètres tels que la température, le pH et le rapport enzyme/substrat peuvent être modifiés pour optimiser les effets spécifiques de l’échantillon.
Assurer une base solide
Les réactifs RapiZyme MC1 et RapiZyme Cusativin ont tendance à s’arrimer au substrat et à le cliver à des endroits spécifiques du dinucléotide. Avec RapiZyme MC1, le clivage a lieu à l’extrémité 5’ de l’uridine et avec RapiZyme Cusativin à l’extrémité 3’ de la cytidine. Les deux enzymes présentent des produits de clivage contrôlés et reproductibles. La nature idiosyncrasique de ces RNases entraîne une digestion partielle, générant des produits plus longs ainsi que des fragments uniques et se recoupant. La digestion partielle, qui fournit pléthore d’informations, crée une plus grande diversité de fragments à étudier en vue de l’élucidation de la structure. L’interprétation des données peut être accélérée grâce à des outils informatiques tels que waters_connect MAP Sequence, qui prédit des fragments in silico (mRNA Cleaver) sur la base des propriétés de clivage connues de l’enzyme choisie et établit une correspondance entre les données observées et la séquence de la molécule d’ARN étudiée.
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