Veränderungen der Peakform im Laufe der Zeit

Wie in den ersten drei Teilen dieser Serie besprochen, sind Probleme mit der Peakform ein häufiges Problem bei HPLC-Analysen. Idealerweise sollten Peaks symmetrisch sein und eine Gauß-Form aufweisen [D. R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021) 353–362]. Die Symmetrie eines Peaks kann durch Berechnen des USP-Tailingfaktors (T) quantifiziert werden. Dies ist in Abbildung 1 dargestellt. Ein Tailingfaktor von 1 weist auf ideale Symmetrie hin, während Werte unter 1 als „Fronting“ und Werte über 1 als „Tailing“ bezeichnet werden. Bei vielen Methoden ist es erforderlich, dass die Tailingfaktoren für alle Peaks innerhalb eines bestimmten Bereichs liegen. Tailingfaktoren, die erheblich von 1 abweichen, können die Auflösung von Peaks, die nah beieinander eluieren, verringern, was die Integration erschwert [D. R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021) 353–362]. Außerdem ist der Peak bei schlechter Peaksymmetrie im Allgemeinen breiter, als er sein sollte, wodurch die Peakhöhe abnimmt. Bei Applikationen, die die Detektion und Quantifizierung von Analyten in niedrigen Konzentrationen beinhalten, kann dies die Präzision der Ergebnisse sowie die Quantifizierungs- und Nachweisgrenzen verringern.

Bei vielen Applikationen wird eine Methode wiederholt zur Analyse einer Gruppe von Proben verwendet. Um sicherzustellen, dass genaue Ergebnisse erhalten werden, ist es wichtig, dass die Säule konsistente Peakbreiten und Tailingfaktoren für die Dauer des Analysesatzes liefert. Dies kann jedoch in der Praxis nicht immer erreicht werden. In dem Beispiel in Abbildung 2 zeigte eine isokratische Trennung von vier Verbindungen nach 100 Injektionen Veränderungen in der Peakbreite und Peaksymmetrie. Eine C₁₈-Silika-Säule wurde mit einer mobilen Phase verwendet, die einen Kaliumphosphatpuffer (pH-Wert 7,0) sowie Methanol (35:65 v/v) enthielt und eine Säulentemperatur von 40 °C aufwies. Wie in den ersten drei Teilen besprochen, gibt es mehrere mögliche Ursachen für Veränderungen der Peaksymmetrie, einschließlich Problemen mit dem HPLC-System, der mobilen Phase, der Probe und der Säule [J. W. Dolan and L. R. Snyder, Troubleshooting LC Systems, Springer Science+ Business Media, New York, 1989, pp. 385–420]. Wie bereits besprochen, besteht ein guter Ausgangspunkt für die Fehlerbehebung darin, die Chromatogramme sorgfältig zu analysieren, um zu beobachten, ob die Veränderung der Peakform bei allen Peaks zu beobachten ist oder nur bei einigen. In den Chromatogrammen in Abbildung 2 wird die größte Veränderung bei Nortriptylin (Peak 1) und eine kleinere Veränderung bei Amitriptylin (Peak 4) beobachtet. Auch für diese beiden Peaks ist eine erhebliche Steigerung der Retentionszeit zu verzeichnen. Die anderen beiden Peaks (Peak 2, 2-Methylnaphthalin und Peak 3, Acenaphthen) weisen kleinere Veränderungen auf. Nortriptylin und Amitriptylin sind basische Verbindungen, wohingegen 2-Methylnaphthalin und Acenaphthen nicht ionisierbar sind. Wenn nur die Peaks der basischen Verbindungen erhöhte Tailing- und Retentionszeiten aufweisen, wie in Abbildung 2B dargestellt, zählen eine Veränderung der mobilen Phase oder der Säule zu den wahrscheinlichen Ursachen. Um zu bestimmen, welche davon die im Chromatogramm in Abbildung 2B gezeigten Veränderungen verursachten, wurde die Säule durch eine neue Säule des gleichen Typs ersetzt. Unter Verwendung derselben mobilen Phase wurde das in Abbildung 2C dargestellte Chromatogramm erhalten. Dieses Chromatogramm zeigt eine Trennung, die der ersten Trennung, die mit der ursprünglichen Säule erhalten wurde, ähnelt. Dies deutet darauf hin, dass der Grund für das erhöhte Tailing bei Injektion 100 eine Änderung der Säule war.

Da die Säule innerhalb der empfohlenen Bereiche für die Temperatur (20 – 45 °C) und den pH-Wert (2 – 8) verwendet wurde, wurde diese relativ schnelle Verschlechterung nicht erwartet. Allerdings ist es wichtig, zu bedenken, dass sich der pH-Wert des wässrigen Puffers ändert, wenn das organische Lösungsmittel (Methanol) hinzugefügt wird. Es wurde berichtet, dass die Verdünnung einer wässrigen Phosphatlösung (pH-Wert 7,05) mit einem gleichen Volumen Methanol zu einem Ansteigen des pH-Werts auf 8,29 führte [I. Canals, J. A. Portal, E. Bosch, M. Roses, Anal. Chem. 72 (2000) 1802–1809]. Da die mobile Phase, die zur Erstellung der Chromatogramme von Abbildung 2 verwendet wurde, 65 % Methanol enthielt, sollte der pH-Wert der mobilen Phase sogar noch höher, über dem empfohlenen Grenzwert von 8 liegen. Die Verwendung einer mobilen Phase mit einem pH-Wert, der über dem empfohlenen Grenzwert liegt, kann zur Hydrolyse der stationären Phase führen, was den Verlust gebundener Gruppen und die Bildung zusätzlicher Silanole sowie einen Effizienzverlust zur Folge hat [J. J. Kirkland, M. A. van Straten, H. A. Claessens, J. Chromatogr. A 691 (1995) 3–19]. Dies ist wahrscheinlich der Grund für die in Abbildung 2B gezeigten Veränderungen der Peakform und Retention.

Bei Verwendung von mobilen Phasen mit einem pH-Wert über 8 ist eine Säule, die mit hybriden organisch-anorganischen Partikeln gepackt ist, robuster als eine C₁₈-Silika-Säule [K. D. Wyndham, J. E. O’Gara, T. H. Walter, K. H. Glose, N. L. Lawrence, B. A. Alden, G. S. Izzo, C. J. Hudalla, P. C. Iraneta, Anal. Chem. 75 (2003) 6781–6788]. Um dies zu demonstrieren, wurde dieselbe Methode mit einer Säule mit hybriden Partikeln (XBridge BEH C₁₈) verwendet, was die in Abbildung 3 gezeigten Ergebnisse liefert. Mit der verbesserten alkalischen Stabilität der Säule mit hybriden Partikeln wurden über 120 Injektionen keine wesentlichen Änderungen der Peakform beobachtet. Diese Ergebnisse zeigen, dass Veränderungen der Peakform im Laufe der Zeit durch eine Hydrolyse der gebundenen Phase verursacht werden können, insbesondere wenn eine Säule nahe dem empfohlenen pH-Wert- und Temperaturgrenzwert verwendet wird. Es ist wichtig, die Auswirkung des organischen Lösungsmittels auf den pH-Wert des wässrigen Puffers zu berücksichtigen, wenn überprüft wird, ob der pH-Wert der mobilen Phase innerhalb des empfohlenen Bereichs für die Säule liegt.