RapiZyme RNasen
Steuerbarer RNA-Verdau für effiziente LC-MS-Sequenzierung
CRISPR sgRNA und mRNA müssen gründlich charakterisiert werden, um ihre Identität, Sequenzen und Reinheit zu bestätigen. Diese RNA-Moleküle sind aufgrund ihrer komplexen Funktionalität, ihrer Modifikationen und der vorhandenen Varianten erstklassige Kandidaten für die LC-MS-Analyse. Aufgrund ihrer Größe wird vor der Injektion häufig ein Verdau mit einer Endonuklease wie z. B. einer RNase durchgeführt. Die resultierenden Verdauungsprodukte können mit Hilfe der Ionenpaar-Reversed-Phase (IPRP) oder der hydrophilen Interaktions-Chromatographie (HILIC) in Verbindung mit der Massenspektrometrie (MS) leicht nachgewiesen werden.
Waters RapiZyme MC1 und RapiZyme Cusativin bieten eine kontrollierte, reproduzierbare RNA-Spaltung an einer Reihe von Dinukleotidstellen. RapiZyme RNasen produzieren eine Vielzahl von einzigartigen RNA-Fragmenten mit komplementärer Überlappung. Für LC-MS-Anwender bedeutet dies steuerbare Verdauungen, die das Vertrauen in die Peak-Identifizierung verbessern und damit die Sequenzabdeckung und den molekularen Einblick erhöhen. Jedes Röhrchen enthält 10.000 Einheiten RapiZyme RNase, d. h. genug Enzymreagenz für bis zu 100 Verdauungsreaktionen von 10 µg RNA-Proben.
- Erzielen Sie eine maximale Sequenzabdeckung für mRNA und sgRNA
- Arbeiten Sie mit RNasen, die speziell für die LC-MS-Analyse entwickelt wurden
- Eliminieren Sie den Bedarf an Denaturierungsmitteln und RNase-Inhibitoren bei der Durchführung des Aufschlusses
- Erzielen Sie ein saubereres Signal und eine höhere Empfindlichkeit mit zyklischen Phosphatprodukten
- Beschleunigen Sie die Entwicklung und Analyse von RNA-Therapeutika
RapiZyme RNasen
Technische Daten
Überblick
- Verbesserte Ergebnisse mit vollständigerer Sequenzabdeckung für die LC-MS-Charakterisierung von RNA
- Verbessern Sie die Effizienz mit hochreinen, hochaktiven Enzymreagenzien auf bis zu 100 Reaktionen je nach Substrat.
- Vereinfachen Sie Ihre Analyse mit einem zur Automatisierung bereiten Protokoll für den Verdau.
- Vermeiden Sie Überverdau und Geräte-/Säulenkontamination durch zuverlässige Wärme-Inaktivierung, die keine zusätzlichen Inhibitor-Reagenzien erfordert.
- Zielen Sie mithilfe von zwei enzymatischen Spezifitäten auf Uridin- oder Cytidin-Reste ab.
- Maximieren Sie die Empfindlichkeit und vereinfachen Sie die Dateninterpretation mit in waters_connect MAP Sequence integrierten Enzymverdaueigenschaften.
- Fügen Sie IonHance HFIP Additiv für die mobile Phase hinzu und profitieren Sie von einer 2-fachen Verringerung unerwünschter Natrium- und Kaliumaddukte.
Empfohlene Verwendung: Für eine verbesserte Sequenzabdeckung bei CRISPR sgRNA- und mRNA-Therapeutika.
Auf Ausschau nach dem Verdau
RapiZyme MC1 und RapiZyme Cusativin weisen reproduzierbare Spaltungsspezifitäten auf. Zur Untersuchung von RapiZyme MC1 und RapiZyme Cusativin wurden doppelt markierte, gequenchte RNA-Substrate eingesetzt. Nach der Spaltung durch die RNase wird ein FAM-markiertes Testsubstrat von seinem Black Hole Quencher-Konjugat getrennt. Das Verdauereignis wird dann mithilfe von Techniken auf Absorptionsbasis erfasst, sodass eine quantitative Messung der On-Target-Spaltung möglich ist. Zusätzlich wird eine Negativkontrolle, das HEX-markierte Substrat (z. B. polyA), angewandt, um die Off-Target-Spaltung zu beurteilen. Das FAM/HEX-Verhältnis gibt Aufschluss über die Aktivität jedes Enzyms und kann unter verschiedenen Bedingungen, einschließlich Temperatur, pH-Wert, Pufferzusammensetzung, Enzymeinheiten und Zeit, durchgeführt werden. Diese Analysen wurden durchgeführt, um die optimalen Reaktionsbedingungen für RapiZyme Cusativin und RapiZyme MC1 zu bestimmen.
Jetzt wird‘s spezifisch
RapiZyme MC1 und RapiZyme Cusativin sind hochreine, hochaktive RNasen, die komplementäre Spaltungsspezifitäten bieten. Diese rekombinanten, abstimmbaren Enzyme sind darauf ausgelegt, die Entwicklung und Analyse von RNA-Therapeutika durch einen kontrollierten Verdau von synthetischen Oligonukleotiden, mRNA und sgRNA zu beschleunigen. RapiZyme MC1 weist die selektivsten und effizientesten Verdauraten bei [A/U/C]pU-Dinukleotidbindungen bei einem pH-Wert von 8 auf, wohingegen RapiZyme Cusativin Cp[U/A/G]-Dinukleotidsequenzen bei einem pH-Wert von 9 am effizientesten und selektivsten spaltet. Parameter wie Temperatur, pH-Wert und Enzym-Substrat-Verhältnis können geändert werden, um probenspezifische Effekte zu optimieren.
Alles Grundlegende abgedeckt
RapiZyme MC1 und RapiZyme Cusativin zeigen eine Präferenz für Substrat-Kopplungen und Spaltungen an spezifischen Dinukleotidpositionen. RapiZyme MC1 hat die Tendenz, am 5'-Ende von Uridin zu spalten, und RapiZyme Cusativin neigt dazu, am 3'-Ende von Cytidin zu spalten. Beide Enzyme weisen kontrollierte, wiederholbare Spaltprodukte auf. Die spezifische Natur dieser RNasen führt zu einem teilweisen Verdau, wodurch längere Produkte neben eindeutigen und überlappenden Fragmenten erzeugt werden. Ein teilweiser Verdau, der eine Fülle an Informationen liefert, erzeugt eine stärkere Vielfalt an Fragmenten, die zur Strukturaufklärung untersucht werden müssen. Die Dateninterpretation kann mit Informatiktools wie waters_connect MAP Sequence beschleunigt werden, die In-silico-Fragmente (mRNA-Spalter) auf Basis der bekannten Spaltungseigenschaften des gewählten Enzyms vorhersagen und die beobachteten Daten der Sequenz des zu untersuchenden RNA-Moleküls zuordnen.
