Évolution de la finesse de pic au fil du temps

Comme expliqué dans les trois premières parties de cette série, les problèmes de finesse de pic sont fréquents dans les analyses HPLC. Idéalement, les pics doivent être symétriques et décrire une courbe gaussienne [D. R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021) 353–362]. La symétrie d’un pic peut être mesurée en calculant le facteur de traînée USP (T), comme illustré à la figure 1. Un facteur de traînée de 1 indique une symétrie parfaite. Les valeurs inférieures à 1 dénotent un front diffus et les valeurs supérieures à 1 une traînée. De nombreuses méthodes imposent que le facteur de traînée de tous les pics se situe dans une plage donnée. Les facteurs de traînée qui s’écartent sensiblement de 1 peuvent diminuer la résolution des pics à élution proche et rendre l’intégration plus difficile [D. R. Stoll, LC-GC N. Am. 39 (2021) 353–362]. En outre, lorsque la symétrie du pic est mauvaise, le pic est généralement plus large qu’il ne devrait l’être, ce qui diminue sa hauteur. Dans les applications impliquant la détection et la quantification d’analytes présents en faibles concentrations, cela peut diminuer la fidélité des résultats ainsi que les limites de quantification et de détection.

Dans de nombreuses applications, une méthode est utilisée à plusieurs reprises pour analyser un groupe d’échantillons. Pour garantir l’exactitude des résultats, il est important que la colonne donne des largeurs de pic et des facteurs de trainée de pic cohérents pendant toute la durée des analyses. Or, il arrive dans la pratique que ce ne soit pas le cas. Dans l’exemple illustré à la figure 2, une séparation isocratique de quatre composés présente des changements de largeur et de symétrie des pics après 100 injections. Une colonne en silice C₁₈ a été utilisée avec une phase mobile contenant un tampon phosphate de potassium à pH 7,0 et du méthanol (35:65 v/v), et une température de colonne de 40 °C. Comme expliqué dans les trois premières parties, plusieurs causes peuvent être à l’origine de changements de la symétrie des pics, notamment des problèmes avec le système HPLC, la phase mobile, l’échantillon et la colonne [J. W. Dolan et L. R. Snyder, Troubleshooting LC Systems, Springer Science+Business Media, New York, 1989, pp. 385–420]. Comme indiqué précédemment, un bon point de départ pour le diagnostic est de se pencher attentivement sur les chromatogrammes pour voir si tous les pics sont concernés ou seulement certains d’entre eux. Sur les chromatogrammes illustrés à la figure 2, le changement le plus important est observé pour la nortriptyline (pic 1), tandis qu’un changement plus faible est constaté pour l’amitriptyline (pic 4). Des augmentations significatives du temps de rétention sont également visibles pour ces deux pics. Les deux autres pics (pic 2, 2-méthylnaphtalène et pic 3, acénaphtène) présentent des changements plus faibles. Il convient de noter que la nortriptyline et l’amitriptyline sont des composés basiques, tandis que le 2-méthylnaphtalène et l’acénaphtène ne sont pas ionisables. Lorsque seuls les pics de composés basiques présentent une augmentation de la trainée de pic et des temps de rétention, comme illustré sur la figure 2B, les causes probables incluent un changement de la phase mobile ou de la colonne. Pour déterminer lequel de ces phénomènes est à l’origine des changements observés sur le chromatogramme de la figure 2B, la colonne a été remplacée par une colonne neuve du même type. En utilisant la même phase mobile, l’analyse a donné le chromatogramme illustré à la figure 2C. Ce chromatogramme présente une séparation similaire à celle initialement obtenue sur la colonne d’origine, ce qui indique que la cause de l’augmentation de la trainée de pic à l’injection 100 est un changement de colonne.

Comme la colonne était utilisée dans les plages de température recommandées (20 – 45 °C) et de pH (2 – 8), cette détérioration relativement rapide n’était pas attendue. Cependant, il est important de prendre en compte le fait que le pH du tampon aqueux change lorsque le solvant organique (méthanol) est ajouté. Il a été rapporté que la dilution d’une solution de phosphate aqueuse de pH 7,05 avec un volume égal de méthanol entraînait une augmentation du pH à 8,29 [I. Canals, J. A. Portal, E. Bosch, M. Roses, Anal. Chem. 72 (2000) 1802–1809]. Étant donné que la phase mobile utilisée pour produire les chromatogrammes de la figure 2 contient 65 % de méthanol, le pH de la phase mobile devrait être encore plus élevé, et supérieur à la limite recommandée de 8. L’utilisation d’une phase mobile de pH supérieur à la limite recommandée peut entraîner une hydrolyse de la phase stationnaire, occasionnant une perte de groupes liés et la formation de silanols supplémentaires, ainsi qu’une diminution de l’efficacité [J. J. Kirkland, M. A. van Straten, H. A. Claessens, J. Chromatogr. A 691 (1995) 3–19]. Cela explique probablement les changements de finesse de pic et de rétention observés sur la figure 2B.

Lors de l’utilisation de phases mobiles avec un pH supérieur à 8, il est préférable de choisir, au lieu d’une colonne en silice C₁₈, une colonne garnie de particules organiques-inorganiques hybrides [K. D. Wyndham, J. E. O’Gara, T. H. Walter, K. H. Glose, N. L. Lawrence, B. A. Alden, G. S. Izzo, C. J. Hudalla, P. C. Iraneta, Anal. Chem. 75 (2003) 6781–6788]. Pour illustrer ce phénomène, la même méthode a été utilisée avec une colonne à particules hybrides (XBridge BEH C₁₈), ce qui a donné les résultats illustrés à la figure 3. Grâce à l’amélioration de la stabilité alcaline de la colonne à particules hybrides, aucun changement significatif de la finesse de pic n’a été observé sur 120 injections. Ces résultats indiquent que les changements de la finesse de pic au fil du temps peuvent être dus à une hydrolyse de la phase greffée, en particulier lors de l’utilisation d’une colonne proche des limites de pH et de température recommandées. Il est important de prendre en compte l’effet du solvant organique sur le pH du tampon aqueux lorsque vous vérifiez que le pH de la phase mobile se situe dans la plage recommandée pour la colonne.