氨基酸水解和分析综合指南

如前所述，有多种专用于辅助样品水解的设备。无论采用何种仪器，通常使用的三种水解方案分别为：酸水解，用于测定总蛋白质组分；过甲酸氧化后进行酸水解，用于测定半胱氨酸和蛋氨酸等含硫氨基酸；碱水解，用于评估色氨酸回收率。传统的样品水解设备的水解过程通常很耗时，但微波水解仪器可以大大加快水解速度。将微波水解应用于所有三种方案可以改善对水解条件的控制，获得更出色的准确度、重现性，提高速度和稳定性。

CEM Discover SP微波反应系统(CEM Corporation, 3100 Smith Farm Road Matthews, NC 28104)（图7）可借助微波技术，在15 min内水解蛋白质和肽，适用于氨基酸分析。如图8中所示，直接应用微波能量并借助集成IR温度传感器，可快速加热每个样品，且能够使样品保持在其设定的温度。原位搅拌可确保样品中的热量分布均匀，且反应后的骤冷过程可在几秒内冷却样品。

以下小节概述了系统设置和操作。有关详细信息，请联系CEM公司或参阅系统手册。

• 系统的电气要求为110–140 VAC、60 Hz、10 A (120 VAC)。
• 系统需要放空。
• 系统需要25–60 psi的压缩空气或压缩氮气。
• 系统需要一台笔记本电脑（由CEM提供），位置应距离系统10英尺以内。

• 6 N HCl（用于酸水解），1:1的浓HCl:去离子水溶液。
• 4 N NaOH（用于碱水解），将16 g固体NaOH溶于100 mL去离子水中。
• 过甲酸（仅用于预氧化），9:1的甲酸:30%过氧化氢溶液。
• 10 mL或35 mL样品瓶，带搅拌棒和瓶盖，用于Discover SP。
• 苯酚晶体。

方法1

1. 称取50–500 mg样品，放入有搅拌棒的35 mL样品瓶中。
2. 将水解试管置于冰浴中处理约15 min。
3. 冷却后，向试管中加入5 mL过甲酸。
4. 用玻璃塞塞住样品试管，置于磁力搅拌板上低速搅拌15 min。
5. 将水解试管放回冰浴中，氧化16 h。
6. 取下玻璃塞，加入0.84 g焦亚硫酸钠以分解过甲酸。
7. 从第5.4.2节“酸水解”中“选项1”的步骤2开始进行酸水解。

方法2

1. 称取50–500 mg样品，放入有搅拌棒的35 mL样品瓶中。
2. 加入6 mL新鲜制备的过甲酸溶液（9:1的甲酸:30%过氧化氢溶液）。
3. 将混合反应溶液在50 °C的水浴中温育1 h。
4. 在蒸发仪(50 °C)中将残留的过甲酸溶液蒸干。
5. 从第5.4.2节“酸水解”中“选项1”的步骤2开始进行酸水解。

选项1：50–300 mg样品

1. 称取样品，放入有搅拌棒的35 mL样品瓶中。
2. 加入3%（重量百分比）的苯酚。
3. 加入5 mL 6 N HCl。
4. 为样品瓶加盖。
5. 使用动态方法控制，将方法设定为300 W，保持15 min，195 °C和300 psi。搅拌速度应设置到高速。
6. 将样品瓶放入Discover腔体内，然后按下Start（开始）键，启动方法。
7. 请在压力不超过250 psi (± 10%)的条件下将样品加热至195 °C。

选项2：300–500 mg样品

1. 称取样品，放入有搅拌棒的35 mL样品瓶中。
2. 加入3%（重量百分比）的苯酚。
3. 加入10 mL 6 N HCl。
4. 为样品瓶加盖。
5. 使用动态方法控制，将方法设定为300 W，保持15 min，195 °C和300 psi。搅拌速度应设置到高速。
6. 将样品瓶放入Discover腔体内，然后按下Start（开始）键，启动方法。
7. 请在压力不超过250 psi (± 10%)的条件下将样品加热至195 °C。

选项1：50–300 mg样品

1. 称取样品，放入有搅拌棒的35 mL样品瓶中。
2. 加入5 mL 4 N NaOH。
3. 为样品瓶加盖。
4. 使用动态方法控制，将方法设定为300 W，保持15 min，195 °C和300 psi。搅拌速度应设置到高速。
5. 将样品瓶放入Discover腔体内，然后按下Start（开始）键，启动方法。
6. 请在压力不超过250 psi (± 10%)的条件下将样品加热至195 °C。

选项2：300–500 mg样品

1. 称取样品，放入有搅拌棒的35 mL样品瓶中。
2. 加入10 mL 4 N NaOH。
3. 为样品瓶加盖。
4. 使用动态方法控制，将方法设定为300 W，保持15 min，195 °C和300 psi。搅拌速度应设置到高速。
5. 将样品瓶放入Discover腔体内，然后按下Start（开始）键，启动方法。
6. 请在压力不超过250 psi (± 10%)的条件下将样品加热至195 °C。

请根据待水解样品的类型设置温度、时间和功率。在整个过程中保持微波正常运行非常重要。可能需要用户进行一些实验，以便通过该技术尽可能地优化样品。

建议在上述步骤中使用正确的样品量、样品体积和容器。这些因素对水解的成功至关重要。样品中的一些组分在水解后将保留在固相中，水解过程中这些组分通常会变黑，如图9所示。这种情况是正常的；氨基酸将进入溶液中。如有关于CEM设备使用的任何疑问，请发送电子邮件到molecular.support@cem.com，或致电1-704-821-7015并转接CEM分子样品制备团队，联系CEM公司。