峰形随时间的变化

如本系列入门指南的前三部分所述，峰形问题是HPLC分析中的常见问题。理想情况下，色谱峰应呈现对称的高斯形状[D. R. Stoll, LC-GC N. Am.39 (2021) 353–362]。峰的对称性可通过计算USP拖尾因子(T)进行定量，如图1所示。拖尾因子等于1表示完全对称，值小于1时称为前延峰，值大于1时称为拖尾峰。许多方法都要求所有峰的拖尾因子必须在指定范围内。拖尾因子明显偏离1时，邻近洗脱峰的分离度可能会降低，导致积分难度增加[D. R. Stoll, LC-GC N. Am.39 (2021) 353–362]。此外，当峰对称性较差时，峰宽通常会增加，导致峰高降低。在涉及低浓度分析物检测和定量的应用中，这可能会降低结果精密度以及定量限和检测限。

在许多应用中，会重复使用同一种方法来分析一组样品。为确保获得准确的结果，在该组分析期间，色谱柱必须能够提供一致的峰宽和拖尾因子。然而，在实际分析中，要做到这一点并非易事。如图2所示，四种化合物的等度分离表明，经过100次进样后，峰宽和峰对称性发生变化。该分析使用C₁₈硅胶色谱柱，流动相为pH 7.0的磷酸钾缓冲液和甲醇(35:65 v/v)，柱温为40 °C。如前三部分所述，导致峰对称性发生变化的原因有很多，包括HPLC系统、流动相、样品和色谱柱的问题[J. W. Dolan and L. R. Snyder, Troubleshooting LC Systems, Springer Science+Business Media, New York, 1989, pp.385-420]。如之前所讨论的，在进行故障诊断排除时建议首先仔细分析色谱图，观察出现峰形变化的是所有峰，还是仅其中一部分峰。在图2所示的色谱图中，变化最大的是去甲替林（峰1），其次是阿米替林（峰4）。这两个峰的保留时间也明显增加。另外两个峰（峰2：2-甲基萘；峰3：苊）的变化较小。值得注意的是，去甲替林和阿米替林属于碱性化合物，而2-甲基萘和苊属于不可电离化合物。如果只有碱性化合物表现出峰拖尾和保留时间增加（如图2B所示），可能的原因包括流动相或色谱柱发生变化。为确定是其中哪一项原因导致图2B中色谱图的变化，分析人员使用同类型的新色谱柱替换了原色谱柱。使用相同的流动相，获得了图2C所示的色谱图。该色谱图的分离效果与最初在原色谱柱上获得的分离效果相似，表明第100次进样时拖尾增加的原因是色谱柱发生变化。

由于色谱柱是在推荐的温度范围(20-45 °C)和pH范围(2-8)内使用，因此预计不会出现相对快速的劣化现象。但需要注意的是，加入有机溶剂（甲醇）后，水相缓冲液的pH会发生变化。据报道，pH 7.05的磷酸盐水溶液用等体积甲醇稀释后，pH可增至8.29 [I. Canals, J. A. Portal, E. Bosch, M. Roses, Anal.Chem.72 (2000) 1802–1809]。由于图2所示色谱图中，使用的流动相含有65%甲醇，因此流动相的pH预计会更高，可能达到推荐的限值8。流动相pH高于推荐限值可能导致固定相水解，使键合基团损失并形成额外硅醇，以及柱效降低[J. J. Kirkland, M. A. van Straten, H. A. Claessens, J. Chromatogr. A 691 (1995) 3–19]。这可能是造成图2B中峰形和保留时间变化的原因。

当流动相pH大于8时，填充杂化有机-无机颗粒的色谱柱相比C₁₈硅胶色谱柱而言，性能更加稳定[K. D. Wyndham, J. E. O’Gara, T. H. Walter, K. H. Glose, N. L. Lawrence, B. A. Alden, G. S. Izzo, C. J. Hudalla, P. C. Iraneta, Anal.Chem. 75 (2003) 6781–6788]。为了证明这一点，我们使用杂化颗粒色谱柱(XBridge BEH C₁₈)以相同的方法进行了分析，结果如图3所示。由于杂化颗粒色谱柱的碱稳定性更高，120次进样中未观察到峰形发生明显变化。这些结果表明，峰形随时间的变化可能是由键合相水解引起的，尤其是在色谱柱使用条件接近推荐的pH和温度限值时。在检查流动相pH是否在色谱柱的建议范围内时，应考虑有机溶剂对水相缓冲液pH的影响，这一点很重要。