ACQUITY QDa质谱检测器在常规肽水平生物治疗药物分析中的应用

摘要

此前的研究已经表明，ACQUITY QDa质谱检测器是光学检测技术的一种互补检测技术，可用于监测生物治疗药物，进而提高单一工作流程的分析效率。制药行业迫切需要既能带来附加价值，又能以最少的精力投入应用到现有工作流程中，而且还具有经济效益的技术。本研究自然延伸为使用代表性生物治疗药物评估ACQUITY QDa质谱检测器的性能。

研究结果表明，ACQUITY QDa质谱检测器与传统LC流动相兼容，并且能够检测和准确报告较宽分子量范围内（生物治疗药物肽图的典型范围）的肽质量数信息。上述结果证明ACQUITY QDa质谱检测器是生物制药分析实验室的理想补充技术，有利于分析人员在常规的肽分析检测中提高分析效率和数据分析的可信度。

优势

在基于Empower软件的现有GMP合规工作流程中添加附加组件
在生物治疗药物的常规肽水平光学分析中增加质谱数据
利用三氟乙酸或甲酸流动相添加剂获得的肽覆盖率相当
采用在线正交检测技术提高分析效率

简介

最近有研究表明，Waters ACQUITY QDa质谱检测器作为一种补充正交检测技术，能够以经济有效的方式为基于光学检测的现有肽分析LC工作流程提供质谱数据¹。

尽管上述原理论证研究令人信服，但研究对象仅限于分子量在899～2848 Da范围内的七种肽组成的参比样品组。

相比之下，生物治疗药物（如单克隆抗体）经酶解处理之后可产生分子量跨越将近三个数量级(150～7000 Da)的肽²。此外，肽图分析中还常常用到三氟乙酸(TFA)等离子对试剂。由于TFA对电离效率有不利影响，因此要获得基于质谱(MS)的肽图相当困难^3,4。之前的研究已经表明，制药行业迫切需要能够带来附加价值，并且投入最低的成本和最少的精力即可应用的正交技术⁵。

本应用纪要旨在证明ACQUITY QDa质谱检测器为检测宽分子量范围的肽（尤其是生物治疗药物的肽图分析）提供了一种经济有效的简单解决方案，并且该质谱检测功能完全兼容基于光学检测的传统LC肽监测分析（使用TFA或甲酸(FA)）。为此，我们采用监测曲妥珠单抗（一种治疗性单克隆抗体(mAb)）肽图的一种现有方法，并应用ACQUITY QDa质谱检测器开展了此次研究。

图1.ACQUITY UPLC H-Class系统，突出显示了ACQUITY QDa质谱检测器。该检测器的紧凑型设计使其非常便于集成到实验室中，用以提高分析效率和改善生物治疗药物生产环境中的过程控制及质量保证。

实验

按照色谱柱维护和使用手册中的说明对ACQUITY UPLC CSH 130Å, C₁₈ (2.1 x 100 mm, 1.7 μm)和ACQUITY UPLC BEH 300Å, C₁₈ (2.1 x 100 mm, 1.7 μm)色谱柱进行平衡处理。化学试剂购自Sigma Aldrich，开封即用，无需其它处理。使用购自Promega的序列级改性胰蛋白酶，按照制造商提供的方案配制浓度为0.5 mg/mL的曲妥珠单抗酶解物（经还原和烷基化）。

液相条件

LC系统	ACQUITY UPLC H-Class
检测器	ACQUITY UPLC TUV ACQUITY QDa
吸收波长	215 nm
样品瓶	总回收样品瓶：12×32mm玻璃，螺口，带盖，无切口
色谱柱：	ACQUITY UPLC CSH 130Å, C₁₈, 1.7 μm, 2.1 x 100 mm肽分析专用柱 ACQUITY UPLC BEH 300Å, C₁₈, 1.7 μm, 2.1 x 100 mm
柱温	65 °C
样品温度	4 °C
进样体积	8 μL
流动相A	水，含0.1% TFA
流动相B	乙腈，含0.1% TFA
流动相C	水，含0.1 % FA
流动相D	乙腈，含0.1% FA

梯度表（BEH色谱柱）

时间(min)	流速(mL/min)	%A	%B	%D
初始	0.2	97	3	0
3	0.2	97	3	0
120	0.2	65	35	0
127	0.2	20	80	6
130	0.2	20	80	0
131	0.2	97	3	0
140	0.2	97	3	0

梯度表（CSH色谱柱）

时间(min)	流速(mL/min)	%C	%D
初始	0.2	99	1
3	0.2	99	1
120	0.2	67	33
127	0.2	20	80
130	0.2	20	80
131	0.2	99	1
140	0.2	99	1

MS条件

采样速率：	2 pts/s
质量范围：	350～1250 Da
锥孔电压：	10 V
毛细管电压：	1.5 kV
探头温度：	500 °C
用于数据采集和处理的信息学软件：	Empower 3软件，SR2

结果与讨论

图2.利用ACQUITY QDa质谱检测器进行肽图分析，使用TFA和ACQUITY UPLC BEH 300Å, C¹⁸, 1.7 µm, 2.1 × 100 mm色谱柱。利用含0.1% TFA (v/v)的流动相同时采集曲妥珠单抗的A)基于光学检测和B)基于MS的肽图。两种检测器的结果之间具有高度相关性，证明ACQUITY QDa可兼容使用TFA的传统方法。

我们的初步原理论证研究已经证明，ACQUITY QDa质谱检测器非常适用于确证宽分子量范围内的肽组分及其浓度¹。在此研究中，我们将流动相中的TFA浓度维持在相对较低的水平(0.02%)，目的是最大限度减小离子抑制效应^3,4。但是，基于光学检测(UV)的肽分析常常会使用较高浓度的TFA来改善常规C₁₈色谱柱的性能⁶。

为了证明ACQUITY QDa质谱检测器与此类传统方法兼容，我们使用常规浓度的TFA对曲妥珠单抗进行了肽图分析。在该实验中，我们对曲妥珠单抗进行胰蛋白酶酶解、还原和烷基化处理，得到0.5 mg/mL的溶液，然后使用含0.1% TFA (v/v)的流动相对其进行分析。如图2A所示，采用120 min的梯度（参见实验部分），使用ACQUITY UPLC BEH 300Å, C₁₈, 1.7 µm色谱柱生成基于光学检测的肽图。相应的质谱检测器响应如图2B所示，由设置在光学检测器之后的在线ACQUITY QDa采集。使用正交检测配置检出的肽具有高度相关性。所得数据清楚地表明，在应用要用到TFA等离子对试剂的传统方法时，ACQUITY QDa质谱检测器可提供质谱数据。

图3.利用ACQUITY UPLC CSH C₁₈肽分析专用柱进行肽图分析。使用含0.1% FA (v/v)的流动相和ACQUITY QDa质谱检测器采集曲妥珠单抗的基于MS的肽图。与使用TFA得到的肽图（图2B）相比，可观察到肽图中的检测器响应有所改善。

随着新型色谱柱上市，相较于TFA，使用FA能够有效改善分析性能⁷，由此引发了一个疑问：在添加了质谱检测器的情况下，传统方法能否更高效地转换至新型色谱柱？

为了回答这个问题，我们利用ACQUITY UPLC CSH C₁₈, 130Å, 1.7 µm肽分析专用柱对相同的样品（与图2所用的样品相同）进行了肽图分析。在该实验中，流动相中含有浓度为0.1% (v/v)的FA，并采用120 min梯度生成肽图。

如图3所示（之前的研究也已证实⁸），表面带电杂化颗粒(CSH)色谱柱独特的表面填料允许使用FA，从而获得更高的检测器响应。鉴于两种色谱柱均支持应用ACQUITY QDa质谱检测器进行肽监测，我们对数据进行了深入解析，以评估使用不同离子对试剂时的监测效果。

表1.肽图电荷态表。此电荷态表源自曲妥珠单抗重链的模拟酶解物，旨在说明使用TFA或FA作为离子对试剂时，ACQUITY QDa检出的各种肽的电荷态。为了进行对比，表中只列出了在TFA和FA实验中均观察到的肽段匹配结果。

流动相中所含离子对试剂的挥发性和酸性会影响多电荷物质（例如肽）的电离和电荷态分布^3,4。为了考察TFA和FA对曲妥珠单抗酶解物样品中各种肽的电荷态分布的影响，我们根据曲妥珠单抗的模拟胰蛋白酶酶解物绘制了其重链肽段的电荷态表格（表1）。

在TFA和FA肽图实验中，ACQUITY QDa质谱检测器的扫描范围均被设置为350 m/z～1250 m/z（最大），表1中较粗的线条突出显示了相关的肽。绿色和蓝色分别指示了使用TFA或FA时是否能观察到这种肽电荷态。

两种颜色的单元格表示该电荷态在两个肽图实验中均能观察到，而灰色单元格表示电荷态在扫描范围内，但没有观察到。

表1清楚地表明，使用TFA或FA作为离子对试剂时，除了一个例外（肽T12），其它所有肽均能观察到多个电荷态。此外，观察到的肽占曲妥珠单抗重链肽的93%。类似地，使用TFA或FA分析曲妥珠单抗酶解物时，还观察到了92%的轻链肽段（具有多个电荷态）。未观察到的肽是未能保留的肽，或者电荷态低于350 m/z实验设置的肽。

由这些数据可以看出，ACQUITY QDa质谱检测器可兼容基于TFA或FA的方法，为监测分析的方法开发提供了极大的灵活性。

图4.肽的质量精度。将理论m/z与实测m/z之间的m/z差值相对于ACQUITY QDa检出的肽平均分子量作图。检出肽的质量精度在仪器标准± 0.2 Da以内。

根据这些结果，我们会自然而然地提出这样一个问题：检出这些肽的电荷态时的准确度如何？

为此，我们使用检出肽的基峰离子(BPI)评估了ACQUITY QDa的质量精度。在该评估中，我们使用各种肽的平均分子量计算BPI的电荷态m/z观测值与理论值之间的差异。

以质量数差异相对于理论平均分子量作图，结果如图4所示。从图4中可以看到，检出肽的BPI衍生质量数在仪器标准± 0.2 Da范围内（以蓝色突出显示），而且其中大部分肽都处于± 0.10 Da的范围内，由此可见，在生物治疗药物的常规分析中，ACQUITY QDa质谱检测器能够在较宽的分子量范围内提供准确的肽质量数信息。

结论

此前的研究已经表明，ACQUITY QDa质谱检测器是光学检测技术的一种互补检测技术，能够提高单一工作流程的分析效率。制药行业迫切需要既能带来附加价值，又能以最少的精力投入应用到现有工作流程中，而且还具有经济效益的技术。

本研究自然延伸为使用代表性生物治疗药物评估ACQUITY QDa质谱检测器的性能。研究结果表明，ACQUITY QDa质谱检测器与传统LC流动相兼容，并且能够检测和准确报告较宽分子量范围内（生物治疗药物肽图的典型范围）的肽质量数信息。

综上所述，这些结果证明ACQUITY QDa质谱检测器是生物制药分析实验室的理想补充技术，有利于分析人员在常规的肽分析检测中提高分析效率和数据分析的可信度。

参考文献

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McCalley, D.V. Overload for ionized solutes in Reversed-Phase High- Performance Liquid Chromatography.Analytical Chemistry.2006; 78(8): 2532-2538.
Lauber, M.A. et al.High-Resolution Peptide Mapping Separations with MS-Friendly Mobile Phases and Charge-Surface-Modified C18.Analytical Chemistry.2013; 85: 6936-6944.
Lauber, M.A., Koza, S.M., Fountain, K. Peptide Mapping and Small Protein Separations with Charged Surface Hybrid (CSH) C18 and TFA-Free Mobile Phases.2013; 720004571en.

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