使用新型固相萃取吸附剂Oasis PRiME HLB改善回收率、重现性和基质效应

本应用纪要着重比较了新型反相SPE吸附剂Oasis PRiME HLB与其它多种最常见的商业化反相SPE产品在分析物回收率和基质效应方面的差异。

Oasis PRiME HLB专为简单快速的SPE方案设计，通过简单的上样-清洗-洗脱流程即可基本上完全去除样品中的内源性磷脂。Oasis PRiME HLB对整个被测药物组的基质效应均较低且较为一致，而其它SPE产品的基质效应和相对偏差都高出许多，尤其是对于晚出峰药物。

Oasis PRiME HLB是SPE领域的一项重要技术进步，它能实现更高的回收率、更低的偏差和基质效应，这也意味着更长的色谱柱使用寿命以及更低的质谱仪离子源维护频率。

优势

• 更简单的SPE方案，无需活化和平衡步骤。
• 与其它竞争反相SPE相比，Oasis PRiME HLB可获得更高且更一致的回收率。
• 与其他竞争厂商的反相SPE相比，可通过更简单的方案去除90%以上的磷脂，显著降低基质效应。
• 目前市场上唯一一款专为去除生物样品中的磷脂而设计的反相SPE。

Oasis PRiME HLB是一种新型反相固相萃取(SPE)吸附剂，能够简化和加速SPE流程，同时较其它样品前处理方法能够获得更洁净的萃取物。在本应用纪要中，我们采用省略了活化和平衡步骤的3步（上样-清洗-洗脱）SPE方案流程，成功地从全血样品中萃取出了22种合成大麻素及其代谢物。所有目标分析物组都获得了出色的回收率(90–110%)和极低的RSD(3–7%)，基质效应(ME)也被控制在适当的范围内。此外，我们还使用其它反相(RP) SPE产品通过推荐的5步SPE方案进行了对比实验，结果获得了较低的回收率（最低46%）和较高的%RSD（最高41%），基质效应也更明显。对于大麻素JWH-203，其它SPE产品均表现出严重的基质效应（离子抑制效应达80%），而Oasis PRiME HLB获得了仅为11%的最低基质效应。研究表明，这与Oasis PRiME HLB的磷脂去除功能直接相关。Oasis PRiME HLB是一款非常成功的新一代反相SPE产品，它能够通过更简单的方案、更短的处理时间获得更洁净的提取物。

材料

AM2233、JWH-015、RCS-4、JWH-203、RCS-8、JWH-210、JWH-073和JWH-018均购自Cerilliant（德克萨斯州圆石）。所有其它化合物和代谢物均购自Cayman Chemical（密歇根州安阿伯）。

各种储备液(1 mg/mL)采用甲醇、DMSO或50:50 DMSO/甲醇配制。所有化合物的混合储备液(10 μg/mL)均使用甲醇配制。

工作溶液使用40%甲醇每日现配。将工作溶液直接加标到全血样品中，制备用于测定回收率的预加标样品。在整个分离过程中监控常见的磷脂。

全血样品大麻素分析的样品前处理方法：

使用Oasis PRiME HLB 10 mg板提取样品。将100 µL的0.1 M硫酸锌/醋酸铵溶液加入100 µL全血样品中并涡旋混合5 s，使血细胞溶解。然后向所有样品中加入400 µL乙腈进行沉淀。将全部样品涡旋10 s并在7000 rcf速度下离心5 min。然后在上样前用1200 μL水稀释上清液。样品直接加载到Oasis PRiME HLB 10 mg板上，无需活化和平衡。用500 µL的甲醇:水(25:75)清洗所有孔洞2次，用500 µL的乙腈/甲醇(90/10)洗脱2次。洗脱液在氮气条件下吹干，并用100 µL 30%的乙腈复溶。将5 µL样品注入UPLC系统。

竞争SPE也是96孔板规格，每孔10 mg吸附剂。样品预处理方法与Oasis PRiME HLB相同。竞争厂家的SPE萃取方案中包括分别使用1 mL甲醇和1 mL水进行的活化和平衡步骤，接下来的上样、清洗和洗脱步骤与Oasis PRiME HLB板相同。请参见图1，了解样品前处理的详细信息。

分析物回收率按照以下公式计算：

%回收率 = (峰面积A/峰面积B) x 100%

 其中，A = 所萃取样品的峰面积，B = 萃取基质样品（萃取后将加入化合物）的峰面积。

基质效应按照以下公式计算：

基质效应 = ((存在基质时的峰面积/无基质时的峰面积)^-1) x 100%

存在基质时的峰面积是指在萃取之后加入化合物的所萃取基质样品的峰面积。无基质时的峰面积指在纯溶剂溶液中的分析物的峰面积。

使用Oasis PRiME HLB的简化3步方案与使用其它SPE产品的标准5步方案

此前已有研究表明，仅当使用Oasis HLB等水可浸润性吸附剂时可以省略活化和平衡步骤。使用大部分类型的SPE吸附剂时，这些步骤是不能省略的。为证明这一点，我们比较了Oasis PRiME HLB、硅胶基质的C₁₈吸附剂和竞争厂商的聚合物型吸附剂的回收率。本实验使用了μElution板和大鼠血浆样品。使用简化方案时，硅胶基质C₁₈吸附剂和竞争厂商的吸附剂获得的回收率极低（图2）。相反，采用这种3步法时，Oasis PRiME HLB吸附剂表现出色，这表明非水可浸润或部分水可浸润性吸附剂（包括聚合物型吸附剂）在研究中均不适用于简化的样品前处理方案（有关详细信息，请参阅应用纪要720005140EN）。为了客观地比较不同吸附剂对合成大麻素的萃取性能，我们对Oasis PRiME HLB应用了3步法，而对其它SPE产品应用了5步法。

色谱

 本实验分析的22种化合物列于表2中，构成了一组包含各类法医毒理学相关合成大麻素的化合物。其中包括金刚烷甲酰吲哚类（AM 1248和AKB48）、萘甲酰吲哚类(JWH 022)、苯乙酰吲哚类（RCS-4和RCS-8）和四甲基环丙基吲哚类（UR-144和XLR11）。还包括JWH-073和JWH-018的主要代谢物，由于其中一些化合物为质谱碎片相同的结构异构体，因此对其准确定量需要达到足够的色谱分离。 

实心核CORTECS颗粒与最佳的色谱柱填充技术相结合可达到出色的色谱性能。使用20 ng/mL校准标准品获得的所有化合物的代表性色谱图如图3所示。液相溶剂梯度见表1。使用CORTECS UPLC C₁₈色谱柱（1.6 μm；2.1 x 100 mm），我们在7.5 min内完成了对所有化合物的分析，总循环时间为8.5 min。所有化合物的峰形良好，无明显的拖尾或不对称，且在5%基线处的所有峰宽小于3 s。 

Oasis PRiME HLB与竞争厂商的反相SPE产品的回收率

本应用纪要中的合成大麻素及其代谢物包含中性、酸性和碱性化合物。使用反相吸附剂能够同时提取所有待测化合物及其代谢物，无论它们带有何种官能团。根据“实验”部分描述的公式，我们计算了Oasis PRiME HLB和竞争厂商的反相SPE产品对所有被测化合物的回收率，结果如图4a和表3所示。对于Oasis PRiME HLB，22种化合物中有21种化合物的回收率在90–110%之间（AM2233的回收率为71%），所有%RSD均在3–7%之间。竞争厂商的反相产品的回收率则要低得多，总体的偏差也更高。竞争产品“EVA”的回收率在60–97%范围内，%RSD范围为1–17%；竞争产品“STX”的回收率在59–92%范围内，%RSD范围为2–27%；竞争产品“PLX”的回收率在46–84%范围内，%RSD范围为3–41%。对于最后7种分析物（JWH-203、JWH-018、RSC-8、UR-144、JWH-210、AB-001和AKB-48），所有竞争厂商的SPE产品的%RSD都高于可接受范围（EVA的%RSD高达17%，STX高达27%，而PLX则高达41%），因此无法确保可靠的定量分析。相反，合成大麻素的高回收率和低%RSD结果表明，使用Oasis PRiME HLB通过简单的上样-清洗-洗脱方案分析其它类似化合物时应该也能获得类似的结果。

基质效应和磷脂去除

基质效应根据“实验”部分所述的公式计算，结果如图4b所示。使用Oasis PRiME HLB时，整个化合物组的基质效应都非常低，仅三种化合物的基质效应超过了25%，平均绝对基质效应仅为11%。对于后洗脱出的化合物（RSC-8、UR-144、JWH-210、AB-001和AKB-48），所有竞争厂商的SPE产品均显示出总体偏高的偏差。此外，对于JWH-203，所有竞争厂商的SPE产品均表现出严重的离子抑制效应。

这清楚地表明，采用竞争厂商的SPE产品得到的提取物中存在着严重的干扰。磷脂分析结果表明，JWH-203与残留磷脂溶血磷脂酰胆碱18:0 (m/z 524.4)共洗脱，竞争厂商的SPE产品未能去除这种磷脂。从图5a中可以看到这种共洗脱现象。图5b展示了JWH-203与磷脂524.4共洗脱对JWH-203造成的离子抑制效应。图5c显示了磷脂的峰面积与该化合物受到的离子抑制效应之间的直接关系。以基质效应对相对磷脂丰度作图，通过该图所得的拟合线性回归曲线表明，这两个因子之间的相关性良好，R²值为0.987。 

Oasis PRiME HLB的一个重要特征是它能够获得较其它样品前处理方法更加洁净的萃取物，与其它SPE产品相比，它还能去除90%以上的内源性磷脂，这是SPE领域的一项重要技术进步。这也是市场上唯一一款可以选择性地去除磷脂的反相SPE吸附剂，从而有效避免发生共洗脱时与相关的化合物发生离子抑制。由于该化合物组中的某些化合物是具有相同质谱碎片的结构异构体，因此要对其准确定量需要达到足够的色谱分离。这就要求我们必须降低样品基质的复杂性，因为调整复杂化合物组的色谱分析条件通常是不可行的。使用Oasis PRiME HLB去除内源性磷脂可得到更洁净的提取物，还能减小回收率的偏差和降低基质效应。使用Oasis PRiME HLB还能够延长色谱柱使用寿命和降低质谱仪离子源的维护频率。

本应用纪要着重比较了新型反相SPE吸附剂Oasis PRiME HLB与其它多种最常见的商业化反相SPE产品在分析物回收率和基质效应方面的差异。Oasis PRiME HLB专为简单快速的SPE方案设计，通过简单的上样-清洗-洗脱流程即可基本上完全去除样品中的内源性磷脂。在对比试验中，我们对Oasis PRiME HLB应用了3步法，而对其它不适用简单的上样-清洗-洗脱3步法的反相SPE产品可以使用推荐的5步法。 

Oasis PRiME HLB获得了更高的回收率和更低的%RSD；22种化合物中有21种获得了90–110%的回收率，而且所有的%RSD都在3–7%范围内。所有其它反相SPE产品的回收率都较低且总体相对偏差较高，最低回收率为46%，最高%RSD为41%。Oasis PRiME HLB对整个被测药物组的基质效应均较低且较为一致，而其它SPE产品的基质效应和相对偏差都高出许多，尤其是对于晚出峰药物。与竞争厂商的产品相比，Oasis PRiME HLB还成功去除了99%的磷脂(MW 524.4)，基本上完全去除了由这种磷脂产生的离子抑制效应。Oasis PRiME HLB是SPE领域的一项重要技术进步，它能实现更高的回收率、更低的偏差和基质效应，这也意味着更长的色谱柱使用寿命以及更低的质谱仪离子源维护频率。 

1. 1. Danaceau, J. P. Chambers, E. E., and Fountain, K. J. Analysis of synthetic cannabinoids from urine for forensic toxicology using Oasis HLB µElution Plates and CORTECS UPLC Columns, Waters Application note (720004780EN)
2. Zhang X. Danaceau, J. P., and Chambers, E. E., Simple, Fast, and Clean Extraction of Synthetic Cannabinoids from Whole Blood Using Oasis PRiME HLB, Waters Application note (720005417EN)
3. Zhang X. , Iraneta P, C., Marszalkowskil F. J., A Simplified Solid Phase Extraction (SPE) Protocol for Bioanalysis using Oasis HLB, Waters Application note (720005140EN)