• 应用纪要

QDa质谱检测器与UV联用高灵敏度检测苯磺酸酯类基因毒性杂质

QDa质谱检测器与UV联用高灵敏度检测苯磺酸酯类基因毒性杂质
  • Margaret Maziarz
  • Mark Wrona
  • Waters Corporation
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摘要

本应用纪要介绍了一种能够稳定快速分析苯磺酸甲酯、乙酯和异丙酯的UPLC方法。

ACQUITY UPLC H-Class系统与ACQUITY UPLC PDA检测器和ACQUITY QDa质谱检测器联用为检测潜在基因毒性杂质提供了一种优异的解决方案，可实现准确的确证和定量。

总的来说，ACQUITY QDa质谱检测器是一款性能稳定且简单易用的检测器，可作为正交检测技术对UV检测进行补充。它可以提供准确可靠的结果，是QC实验室对药物产品进行常规检测的理想技术。

优势

  • 紫外和QDa质谱检测器联用，加上稳定快速的UPLC方法实现苯磺酸甲酯、乙酯和异丙酯的高通量分析
  • 采用ACQUITY QDa检测器质量数检测功能对组分进行准确鉴定
  • 使用ACQUITY QDa质谱检测器提高基因毒性杂质监测的灵敏度和选择性

简介

基因毒性杂质(GTI)是药物合成过程中可能形成的中间体或反应产物。除工艺杂质之外，某些药物在配制或储存过程可通过降解产生GTI1。基因毒性化合物可能与DNA发生反应，从而导致致癌反应和肿瘤发展。因此，在早期药物开发过程中必须对这些杂质进行鉴定，因此准确测定药物和药物产品中这些杂质的可靠且高度灵敏的方法就显得至关重要。 

监管机构（包括欧洲药品管理局(EMEA)、美国FDA和国际协调会议(ICH M7)）发布了关于药物成分中基因毒性杂质允许限值的指导原则，以确保药品的安全2-4。 指导原则要求药物或药品中的所有潜在基因毒性杂质(PGI)均必须低于每日1.5 μg的毒理学关注阈值(TTC)（基于药物化合物终身暴露的每日最大剂量）。对于较短的暴露持续时间而言，每日摄入量高于1.5 μg是可以接受的。根据ICH M7指导原则的规定，在短于终身(LTL)至终身暴露期间的“交错”TTC可接受限值列于表1中4。

表1.交错毒理学关注阈值(TTC)。根据ICH M7指导原则的规定，在短于终身(LTL)至终身暴露期间单一杂质的每日可接受摄入量4。

在制药行业中，基因毒性杂质通常相对于药品中的API剂量进行报告。这意味着10 ng/mL的定量限（例如）对应于含1 mg API产品的限值为10 ppm。针对不同API剂量计算得到的定量限(ppm)的示例如表2所示。

表2.药品中不同API剂量下的定量限计算值(ppm)。

甲磺酸（甲磺酸盐）、苯磺酸（苯磺酸盐）和对甲苯磺酸（甲苯磺酸盐）等磺酸常用作API的配对离子形成盐。这些磺酸可与残留醇类相互作用，形成的烷基磺酸酯可看作PGI1。 当前文献中用于分析这些烷基磺酸酯的方法包括液相色谱与质谱联用法以及GC-MS1。 这两种技术虽然有效，但是或者操作过于复杂或者需要柱前衍生步骤以提高分析物的可检测性，不适用于日常常规检测。质谱检测器与UPLC联用能够直接而准确地分析烷基磺酸酯，无需柱前衍生方案。UPLC-QDa方案同时提供了快速分析药品中低浓度潜在基因毒性杂质时所需的选择性和灵敏度。 

本应用纪要介绍了一种能够稳定快速分析苯磺酸甲酯、乙酯和异丙酯的UPLC方法。该UPLC方法使用UV与配备ACQUITY QDa质谱检测器的质谱检测系统，可快速准确地监测基因毒性杂质。我们将展示该方法中UV和质谱检测均可实现的线性、灵敏度和专属性。此外，我们将应用该方法分析苯磺酸氨氯地平原料药。总之，通过采用质谱检测，我们能够提高方法的灵敏度和选择性，这对于分析药物样品中的低浓度杂质至关重要。

实验

样品描述

本研究中所用的材料包括：

  • 苯磺酸甲酯（Sigma，部件号165956）
  • 苯磺酸乙酯（Sigma，部件号S544787）
  • 苯磺酸异丙酯（Cayman Chemicals，部件号17795）
  • 苯磺酸（Sigma，部件号12635）
  • 苯磺酸氨氯地平API（Sigma，部件号A5605-50MG）

标准品溶液

利用甲醇配制苯磺酸甲酯、乙酯和异丙酯的独立储备液，浓度为1.0 mg/mL。将等体积的各种储备液移至一个样品瓶中，并用标准稀释剂（20:80甲醇/5 mM醋酸铵）进行稀释，制得各种分析物浓度均为50 μg/mL的混合溶液。用标准稀释剂（20:80甲醇/5 mM醋酸铵）连续稀释该混合溶液，制得线性标准品溶液。

UV检测标准曲线的浓度配制如下：50、100、500、1000、2500、5000、7500和10000 ng/mL。MS检测的标准曲线浓度包括：1.5、7.5、15、25、50、75、100、250和500 ng/mL。

API样品

将苯磺酸氨氯地平API溶解于甲醇中，得到浓度为2 mg/mL的溶液，然后用稀释剂（20:80甲醇/5 mM醋酸铵）将其稀释为1 mg/mL。

 

UPLC条件

LC系统：

ACQUITY UPLC H-Class

色谱柱：

ACQUITY UPLC CSH C18, 1.7 μm, 2.1 mm x 50 mm

柱温：

40 °C

流速：

0.6 mL/min

进样体积：

8.0 µL（分析甲酯时优化为10 μL，以提高MS检测的灵敏度）

溶剂A：

5 mM醋酸铵水溶液（分析甲酯时优化为1 mM醋酸铵，以提高MS检测的灵敏度）

溶剂B：

甲醇

分离：

梯度

清除清洗液：

50:50水/甲醇

样品清洗液：

50:50水/甲醇

密封清洗液：

90:10水/乙腈

UV检测器：

ACQUITY UPLC PDA，200～400 nm，在220 nm下检测

步骤

时间(min)

%A

%B

曲线

1

初始

90

10

初始

2

3.5

10

90

6

3

4.0

10

90

6

4

4.5

90

10

6

5

6.5

90

10

6

MS条件

质谱检测器：

ACQUITY QDa（性能选件）

电离模式：

ESI+，ESI

MS采集时间：

0～3.5 min

MS采集范围

100～250 Da

SIR(+)：

190.0、204.0和218.0 Da

采样速率：

10 pts/s

毛细管电压：

正1.4 kV，负0.8 kV

锥孔电压：

6 V

探头温度：

300 °C

数据：

质心

数据管理

Empower 3 CDS软件

结果与讨论

苯磺酸甲酯、乙酯和异丙酯的化学结构如表3所示。分离这些化合物得到的UV和MS色谱数据如图1所示。UV谱图（图1a）表明苯磺酸在其甲酯、乙酯和异丙酯之前洗脱。在质量范围（100～250 Da）内采集的ACQUITY QDa MS数据（图1b和1c）称为总离子流色谱图(TIC)，表明在ESI+模式下可检测出烷基酯，而在ESI-模式下可检测出苯磺酸。质谱数据表明酯类形成了铵加合物[M+NH4]+。

表3.本研究中考察的基因毒性杂质：苯磺酸甲酯、乙酯和异丙酯。
图1.分离苯磺酸甲酯、乙酯和异丙酯得到的UV和MS色谱数据。将苯磺酸用作参比物质以说明所有组分均得到分离。 

UV检测

UV数据表明，苯磺酸甲酯、乙酯和异丙酯在50～10,000 ng/mL之内的七个浓度水平下具有可接受的线性，使用线性拟合得到的相关系数(R2) ≥ 0.9991（图2）。

图2.采用UV在220 nm下得到的苯磺酸甲酯、乙酯和异丙酯的方法线性。 

分别按照3:1和10:1的信噪比标准来确定检测限(LOD)和定量限(LOQ)。  对含苯磺酸酯标准品的六次重复进样数据进行评估，以确定和验证LOD和LOQ限值下的性能。采用UV检测得到的烷基磺酸酯的LOD和LOQ值列于表4中。苯磺酸甲酯/乙酯以及苯磺酸异丙酯的LOQ值分别为50 ng/mL和100 ng/mL。

表4.采用UV在220 nm下得到的苯磺酸甲酯、乙酯和异丙酯的检测限和定量限。 

MS检测

在醋酸铵流动相条件下，苯磺酸甲酯、乙酯和异丙酯形成铵加合物[M+NH4]+。 使用单离子记录(SIR)模式测量这些离子，以测定单个目标离子的强度（图3）。在靶标分析检测中，SIR模式提高了方法灵敏度并简化了分析和定量。

为优化苯磺酸甲酯的灵敏度，对1～20 mM范围内的不同醋酸铵浓度进行了考察。结果表明采用1 mM醋酸铵可获得最高的MS响应。此外，将进样体积从8 μL增加至10 μL能够进一步提高甲酯的灵敏度。 

图3.苯磺酸甲酯、乙酯和异丙酯的MS SIR数据。标准品溶液浓度为1 µg/mL。

对采用质谱检测1.5～500 ng/mL苯磺酸甲酯、乙酯和异丙酯的方法线性进行了评估，所得到的方法线性可接受，相关系数(R2) ≥ 0.9984（图4）。

图4.采用质谱检测得到的苯磺酸烷基酯的方法线性。使用MS SIR采集模式在通道1：190.0、通道2：204.0和通道3：218.0 Da下对数据进行处理。

使用含苯磺酸酯标准品的六次重复进样所生成的信噪比数据测定LOD和LOQ。MS检测的LOQ和LOD值列于表5中。发现苯磺酸甲酯/乙酯以及苯磺酸异丙酯的LOQ分别为7.5 ng/mL和1.5 ng/mL。

对于所有三种苯磺酸酯而言，LOQ溶液六次重复进样所得的保留时间和峰面积重现性较高，RT和峰面积的%RSD分别小于0.05%和7.67%。

表5.使用MS SIR数据测得的苯磺酸甲酯、乙酯和异丙酯的检测限和定量限。 

苯磺酸氨氯地平API的分析

苯磺酸氨氯地平API是氨氯地平的苯磺酸盐形式，用于治疗血压偏高（高血压）、胸痛（心绞痛）及冠状动脉疾病引起的其他病症5。其常见形式为口服片剂，每片含2.5 mg、5 mg和10 mg药物，推荐的最大剂量为每日10 mg。在苯磺酸氨氯地平API成盐的过程中，苯磺酸可能与残留醇类反应，形成具有潜在基因毒性的烷基酯（图5）。因此，监测该药物中是否存在这些酯类化合物对于确保药品的安全性至关重要。

图5.苯磺酸氨氯地平API的成盐途径和苯磺酸潜在基因毒性醇酯的形成。

在低浓度或痕量分析中，需要在存在样品基质的情况下对杂质进行分离与准确测量。为证明本文所用MS方法的专属性，我们在苯磺酸氨氯地平API中加标了LOQ浓度的三种苯磺酸烷基酯。在含有1 mg/mL API的样品中分别加标7.5 ng/mL苯磺酸甲酯以及1.5 ng/mL苯磺酸乙酯和苯磺酸异丙酯。LOQ标准品、未加标API样品和加标烷基酯的API样品的MS色谱数据分别如图6、图7和图8所示。数据表明，未加标的苯磺酸氨氯地平样品中不含在烷基酯保留时间处洗脱的任何峰。数据还表明LOQ标准品和加标药物样品中烷基酯的信噪比相当。此外，在加标浓度为LOQ的API样品中，分析物的平均回收率为90%～110%，六次样品进样回收率的%RSD为4.71～5.69（图9）。结果证明在存在苯磺酸氨氯地平API的情况下，苯磺酸甲酯、乙酯和异丙酯可准确测量。

图6.分析苯磺酸甲酯得到的MS SIR数据。LOQ标准品（浓度为1 mg/mL的未加标API样品）以及加标7.5 ng/mL苯磺酸甲酯的API样品。 
图7.分析苯磺酸乙酯得到的MS SIR数据。LOQ标准品（浓度为1 mg/mL的未加标API样品）以及加标1.5 ng/mL苯磺酸乙酯的API样品。
图8.分析苯磺酸异丙酯得到的MS SIR数据。LOQ标准品（浓度为1 mg/mL的未加标API样品）以及加标1.5 ng/mL苯磺酸异丙酯的API样品。 
图9.从加标浓度为LOQ的1 mg/mL苯磺酸氨氯地平API样品中获得的苯磺酸甲酯、乙酯和异丙酯的回收率结果。在MS SIR采集模式下处理数据。 

如简介中所述，基因毒性杂质通常相对于药品中API剂量的ppm浓度进行报告。这意味着在我们的方法中，7.5 ng/mL的苯磺酸甲酯MS定量限对应于1 mg/mL API溶液中的7.5 ppm。溶液中存在5 mg/mL API时这一限值也可得到准确测量，其对应于1.5 ppm。该值低于之前设定的15 ng/mL的值，而15 ng/mL在50 mg/mL的API样品浓度下报告为0.33 ppm6。 表6展示了由含有1 mg/mL和5 mg/mL API的样品溶液计算得到的苯磺酸甲酯、乙酯和异丙酯的定量限(ppm)。

表6.相对于溶液中的API浓度计算得到的苯磺酸甲酯、乙酯和异丙酯的MS方法定量限(ppm)。

结论

ACQUITY UPLC H-Class系统与ACQUITY UPLC PDA检测器和ACQUITY QDa质谱检测器联用为检测潜在基因毒性杂质提供了一种优异的解决方案，可实现准确的确证和定量。

ACQUITY QDa能够通过质量数快速准确地确证色谱峰。使用质谱检测器和单离子扫描(SIR)提高了分析样品中低浓度杂质专属性和灵敏度。MS方法在定量限水平上的良好的重现性和准确性，证明质谱检测器适用于药品中基因毒性杂质的常规监测。此外，UPLC与质谱检测器联用的结果表明，1-5 mg/mL API时对应的定量限满足有关基因毒性杂质分析的法规要求。

总的来说，ACQUITY QDa质谱检测器是一款性能稳定且简单易用的检测器，可作为正交检测技术对UV检测进行补充。它可以提供准确可靠的结果，是QC实验室进行药品常规检测的理想技术。

参考文献

  1. Liu D.Q., Sun M., Kord A.S. Recent Advances in Trance Analysis of Pharmaceutical Genetoxic Analysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis.2010.999-1014.
  2. The European Medicines Evaluation Agency (EMEA), Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP), Guidelines on the limits of Genotoxic Impurities, CPMP/SWP/5199/02, 28 June 2006.
  3. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER).Guidance for Industry, Genotoxic and Carcinogenic Impurities in Drug Substances and Products: Recommended Approaches.December 2008.
  4. ICH M7, Assessment and Control of DNA Reactive (Mutagenic) Impurities in Pharmaceuticals to Limit Potential Carcinogenic Risk.International Conference on Harmonization.23 June 2014.
  5. http://dailymed.nlm.nih.gov/dailymed/archives/fdaDrugInfo.cfm?archiveid=5549
  6. Taylor G.E., Gosling M., Pearce A. Low Level Determination of p-Toluenesulfonate and Benzenesulfonate Esters in Drug Substance by High Performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometry.Journal of Chromatography A.2006.1119:231-237.

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