使用Oasis PRiME HLB固相萃取(SPE)产品和UPLC CORTECS C18色谱柱改进口腔液中THC及其代谢物的萃取性能

本应用纪要详细介绍了在法医毒理学应用中使用µElution板规格的新型SPE吸附剂Oasis PRiME HLB萃取口腔液样品中的THC-OH、THC-COOH和THC的研究。

这种吸附剂能够省略活化和平衡步骤，简化萃取步骤，加快样品前处理流程。此外，使用µElution板得到的萃取物无需挥干或复溶即可直接进样分析，大幅降低了非特异性吸附和样品损失的风险。由于性质特殊，口腔液基质会产生一些在其他基质中观察不到的离子抑制效应。为克服这种信号抑制效应，本研究使用CORTECS C₁₈色谱柱提高柱效，并通过添加5%浓氨水优化了SPE清洗步骤。得益于这些改进，该方法的基质效应可忽略不计(<10%)，且标准曲线的R²值均大于0.999。

综上所述，本研究使用Oasis PRiME HLB处理口腔液样品，成功达到了一致的回收率，基质效应极低，而且能在覆盖4个数量级的范围内实现准确定量。

优势

• 一种经过半验证的方法，适用于通过非侵入性方式即可轻松收集的口腔液样品
• 相较于使用传统SPE吸附剂，样品前处理工作流程更快速、更简单
• 出色的回收率始终如一，基质效应极低
• μElution板规格无需挥干或复溶步骤
• 针对所有分析物均可获得线性、准确、精密的结果

大麻一直都是滥用现象非常普遍的娱乐性药物。随着越来越多的国家/地区将大麻的医疗用途合法化，加上大麻娱乐用途合法化的趋势，人们迫切需要能够定量分析Δ-9-四氢大麻酚(THC)及其代谢物（包括活性代谢物11-羟基-Δ-9-四氢大麻酚(THC-OH)和非活性代谢物11-去甲-9-羧基-Δ-9-四氢大麻酚(THC-COOH)）的分析方法¹。 过去，人们一直使用尿液评估大麻使用情况，近来口腔液也成为了一种使用越来越普遍的检测基质。口腔液的采集相对而言更易实施，而且是一种非侵入性操作，还可以在密切监督下完成。此外，与尿液中的浓度相比，口腔液中的药物和代谢物浓度更能反映受试对象当前的身体受损程度，因此更能证明受试对象在取样时正在经历药理作用^2,3。 据研究报道，大麻使用者口腔液中THC的cut-off水平为2 ng/mL⁵，这是任何分析方法应该都能准确定量的浓度水平。

本文详细介绍了一种使用Oasis PRiME HLB µElution板从口腔液中萃取THC及其主要代谢物（11-THC-OH和11-THC-COOH），然后进行UPLC-MS/MS分析的方法。其SPE步骤操作简单且非常高效，使用兼容LC的溶剂进行洗脱，无需挥干和复溶样品即可直接进样。该方法的分析速度很快，所有分析物均可在3 min内洗脱。所有化合物都获得了优异的回收率（都在75%以上，%RSD < 6），且基质效应极低(< 10% ME)。定量结果重现性良好。所有标准曲线均呈线性，R²值大于0.999。质量控制结果在预期浓度的10%范围内，平均%RSD小于3%。

材料

所有标准品和稳定同位素标记的内标均购自Cerilliant（美国德克萨斯州圆石）。使用40%的甲醇配制浓度为100 µg/mL的标准品储备液（THC、THC-OH和THC-COOH）。含100 ng/mL THC-D3、THC-OH-D3和THC-COOH-D3的内标工作溶液也由40%甲醇配制。单个标准曲线样品和质量控制标准品使用40%甲醇每日现配。从各标准曲线样品工作溶液中或QC标准品中取200 μL加入1800 μL口腔液样品中，用于绘制标准曲线和制备QC样品。所有分析物的标准曲线浓度范围均为0.05~100 ng/mL。配制的质量控制样品在口腔液中的浓度为0.375、1.75、7.5和37.5 ng/mL。

样品前处理

样品预处理

使用购自Immunalysis的Quantisal收集装置，按照制造商的说明收集口腔液样品。用（加标的）口腔液饱和收集工具，然后将其放入装有3.0 mL样品稳定缓冲液的收集瓶。根据Quantisal的说明，这相当于收集1.0±0.1 mL样品。然后，向收集瓶中加入1 mL乙腈，帮助改善萃取效果。将收集套装放入冰箱中储存过夜，目的是模拟样品转运时间，以及让收集垫中的样品与收集瓶中的稳定缓冲液混合物达到完全平衡。 

使用Oasis PRiME HLB µElution板进行固相萃取

取500 μL经过缓冲液稳定的口腔液样品（相当于100 μL口腔液），加入200 μL 4% H₃PO₄和10 μL混合内标工作溶液（100 ng/mL，溶于40% MeOH）进行预处理。

将预处理后的全部样品（共710 μL）直接上样至Oasis PRiME HLB µElution板，无需活化或平衡，然后用250 μL 5% NH₄OH的甲醇:水(25:75)溶液清洗，清洗步骤重复执行2次。用25 µL的乙腈:甲醇(90:10)对每个孔执行洗脱，洗脱步骤重复执行2次，然后用50 µL水稀释。取5 µL进样至UPLC-MS/MS系统。图1总结了SPE萃取步骤。

分析物回收率按照以下公式计算：

其中，A = 所萃取样品的峰面积，B = 萃取空白基质样品（萃取后加入化合物）的峰面积。

存在基质时的峰面积是指在萃取之后加入化合物的所萃取基质样品的峰面积。无基质时的峰面积指在纯溶剂溶液中的分析物的峰面积。

色谱分析

图2是分析萃取后的1 ng/mL标准曲线样品得到的三种大麻素的代表性UPLC色谱图。使用CORTECS UPLC C₁₈色谱柱，所有化合物都在3 min内洗脱。所有化合物峰形良好，5%基线处的所有峰宽小于1.8 s。

表2列出了各大麻素及其稳定同位素标记内标的UPLC分离保留时间和各自的MS参数，包括MRM通道、锥孔电压和碰撞能量。每个化合物均采用两个MRM通道，定性通道(列在第一行)和定量通道(列在第二行)。 

回收率和基质效应

萃取回收率较高，且一致性良好。如图3所示，所有分析物的回收率都不低于75%，所有%RSD均小于6%，展示了Oasis PRiME HLB良好的重现性。基质效应很小，所有化合物的基质效应均小于10%。标准差相当低（6%或更低），再次证明Oasis PRiME HLB具有良好的萃取和净化一致性。所有回收率和基质效应数据汇总于表3中。SPE清洗步骤有必要进行优化，消除口腔液的基质抑制效应。向清洗溶液中添加5%的浓氨水可以大幅减小这种抑制作用，基本消除基质效应。

定量结果

标准曲线样品和质量控制样品按照前文“材料和方法”部分的说明进行制备。THC-COOH和THC-OH的标准曲线范围是0.1~100 ng/mL，THC的标准曲线范围是0.05~100 ng/mL。质量控制样品配制为标准曲线范围内相应的低、中和高浓度。

标准曲线样品和质量控制样品(QC)的测定结果表明，该方法具有良好的线性、准确度和精密度。所有化合物在整个标准曲线范围内均有线性响应，1/x加权拟合的R²值大于或等于0.999。图4显示了所有化合物的标准曲线，表4汇总了这些标准曲线的数据。THC-OH和THC-COOH的定量下限(LLOQ)为0.1 ng/mL，THC的定量下限为0.05 ng/mL。所有检测均遵守FDA针对验证方法准确度、精密度、线性和分析灵敏度的所有建议⁴。

浓度为0.375、1.75、7.5和37.5 ng/mL的质量控制样品得到了准确精密的测定结果。所有QC样品的测定结果都在其各自目标值10%的范围以内，大部分在5%以内。数据列于表5中。这证明了该方法在包含所有预期样品浓度的标准曲线范围内，可得到线性、准确、精密的结果。此外，本研究还证明该方法具有足够的选择性和灵敏度，可用于常规测定口腔液中远低于cut-off水平(2 ng/mL)的THC。分析0.375 ng/mL的QC样品时，该方法展现出良好的准确度和精密度，六次重复进样的浓度计算值与预期值相比的平均标准差仅为6%，这个结果很好地证明了这一点。 

本应用纪要详细介绍了在法医毒理学应用中使用µElution板规格的新型SPE吸附剂Oasis PRiME HLB萃取口腔液样品中的THC-OH、THC-COOH和THC的研究。这种吸附剂能够省略活化和平衡步骤，简化萃取步骤，加快样品前处理流程。此外，使用µElution板得到的萃取物无需挥干或复溶即可直接进样分析，大幅降低了非特异性吸附和样品损失的风险。由于性质特殊，口腔液基质会产生一些在其他基质中观察不到的离子抑制效应。为克服这种信号抑制效应，本研究使用CORTECS C₁₈色谱柱提高柱效，并通过添加5%浓氨水优化了SPE清洗步骤。得益于这些改进，该方法的基质效应可忽略不计(<10%)，且标准曲线的R²值均大于0.999。

所有化合物的回收率一致性良好，回收率>75%，RSD低于6%，且基质效应极小。对于所有化合物，此方法的线性、准确度、精密度和分析灵敏度都非常出色。所有QC样品的测定准确度都在目标浓度10%以内，平均%RSD小于3%，证明该吸附剂与UPLC-MS/MS方法相结合，可以达到出色的重现性。综上所述，本研究使用Oasis PRiME HLB处理口腔液样品，成功达到了一致的回收率，基质效应极低，而且能在覆盖4个数量级的范围内实现准确定量。

1. Huestis, M.A., Henningfield, J.E., Cone, E.J.: Blood Cannabinoids.I. Absorption of THC and Formation of 11-OH-THC and THCCOOH During and After Smoking Marijuana. Journal of Analytical Toxicology 16(5), 276–282 (1992).
2. Kintz, P., Cirimele, V., Luders, B.: Detection of Cannabis in Oral Fluid (Saliva) and Forehead Wipes (Sweat) from Impaired Drivers. Journal of Analytical Toxicology 24, 557–561 (2000).
3. Niedbala, R.S., Kardos, K.W., Fritch, D.F., Kardos, S., Fries, R., Waga, J.: Journal of Analytical Toxicology 25, 289–303, (2001).
4. Bansal, S., DeStefano, A.: Key elements of bioanalytical method validation for small molecules.The AAPS Journal 9(1), E109-E114 (2007).
5. Chi, E., Cole, J.: Using an MRM method on a GC-triple quadrupole MS to confirm and quantitate THC in oral fluid is an effective alternative to blood and urine sample.The Forensic Magazine, 17–21 , Nov (2010).