• 应用纪要

高分辨率和低分辨率质谱与纳升级LC和微流LC平台相结合，定量分析人血清中的肽生物标志物

高分辨率和低分辨率质谱与纳升级LC和微流LC平台相结合，定量分析人血清中的肽生物标志物
  • Billy J. Molloy
  • Chris Hughes
  • Johannes P.C. Vissers
  • James I. Langridge
  • Waters Corporation
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摘要

在本应用纪要中，研究人员全面比较了串联四极杆质谱仪与飞行时间质谱仪在肽类生物标志物MRM定量分析方面的性能。

对于需要定量分析低浓度胰蛋白酶肽段的转化研究而言，微流LC平台与Xevo TQ-S串联四极杆质谱仪联用的系统是理想之选。

优势

  • 采用八个不同的LC-MS平台定量分析未分馏、未除高丰度的胰蛋白酶酶解血清样品中的多种酶解肽段并进行比较
  • 灵敏度低至埃摩尔级别
  • 通量更高，适用性更强，适用于转化研究中的大规模组学研究
  • 优异的线性动态范围和重现性

简介

基于LC-MS的靶向方法被越来越多地应用于发现后蛋白质组学研究，其中，作为转化研究的第一个阶段，验证研究尤其受重视1 。此类实验必须以高通量、高灵敏度、宽泛的线性动态范围和优异的选择性分析大规模的组学样品，因此技术挑战性极高。基于多反应监测(MRM)的方法具有证明生物标志物可接受性所需分析性能的潜力。 

本应用纪要将串联四极杆质谱仪和飞行时间质谱仪与纳升级和微流(ionKey)液相色谱平台相结合，对经胰蛋白酶酶解的未分馏、未除高丰度的人血清样品中的肽进行MRM的定量分析，并全面比较了不同的LC-MS配置。不同的LC和MS平台相结合组成了八套不同的LC-MS配置。此外，我们还比较了这些平台的通量、灵敏度、线性和重现性，以证明它们在转化研究中用于分析大规模样品组的适用性。

图1.LC-MS平台比较研究的实验设计。

实验

以购自PepScan（荷兰莱利斯塔德）的十五种稳定同位素标记的(SIL)肽段代表假定的心血管疾病蛋白质生物标志物。为所有肽制备6.25 amol至12.5 fmol/µL的稀释系列，并同时加标到未分馏、未除高丰度的胰蛋白酶酶解人血清样品中。 

人血清样品制备

80 µL 50 mM碳酸氢铵(aq)稀释20 µL未分馏、未除高丰度的人血清样品，并采用10 µL 1% RapiGest溶液在80 °C下变性45分钟。加入5 µL 100 mM二硫苏糖醇，在60 °C下使血浆蛋白质还原30分钟，然后加入6 µL 200 mM碘乙酰胺，于室温下避光进行烷基化反应30分钟。加入40 µL 1 µg/µL的测序级胰蛋白酶以启动蛋白质酶解，并在37 °C下温育过夜。接下来加入1% TFA，于37 °C下处理45分钟，以分解酸不稳定的表面活性剂。以13000 rpm离心肽溶液10分钟并收集上清液。在使用之前用水稀释所得溶液，使得血清酶解物的柱上进样量为200 ng（假定总蛋白质浓度为100 g/L）。 

用于纳升级分离的LC条件

LC系统：

ACQUITY UPLC M-Class

捕集柱：

ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18, 5 μm, 180 μm x 20 mm

分析柱：

ACQUITY UPLC M-Class HSS T3 C18, 1.8 μm, 75 μm x 250 mm

柱温：

分析柱柱温35 °C

样品温度：

8 °C

进样体积：

1 μL

流速：

300 nL/min

流动相A：

0.1%甲酸

流动相B：

含0.1%甲酸的乙腈

梯度：

在90 min内，流动相B由3%升至40%

用0.1%甲酸(aq)将1 µL样品转移至捕集柱，流速为5 µL/min，持续3分钟。流动相A为0.1%甲酸(aq)，流动相B为含0.1%甲酸的乙腈。经脱盐和预浓缩处理之后，将肽从捕集柱洗脱至分析柱，并用90分钟内流动相B由3%升至40%的梯度和300 nL/min的流速对其进行分离，然后用85%流动相B清洗色谱柱2分钟。接下来，重新平衡色谱柱20分钟，使其恢复初始条件。分析柱温度维持35 ℃。

用于微流分离的LC条件

LC系统：

使用Xevo TQ-S、Xevo TQ-S micro、Xevo G2-XS QTof和SYNAPT G2-Si的MRM

装置：

iKey BEH C18, 1.7 μm, 150 μm x 100 mm肽分析专用装置

柱温：

35 °C

样品温度：

8 °C

进样体积：

1 μL

流速：

1 μL/min

流动相A：

0.1%甲酸

流动相B：

含0.1%甲酸的乙腈

梯度：

在45 min内，流动相B由3%升至40%

将1 µL样品直接加至iKey分离装置。采用45分钟内流动相B由3%升至40%的梯度和1 µL/min的流速进行肽分离，然后用85%流动相B清洗色谱柱6分钟。接下来重新平衡ionKey 9分钟，使其恢复初始条件。分析柱温度维持35 ℃。

MS条件

MS系统：

使用Xevo TQ-S、Xevo TQ-S micro、Xevo G2-XS QTof和SYNAPT G2-Si的MRM

电离模式：

ESI+

离子源温度：

100 °C

毛细管电压：

3.4 kV

锥孔电压：

30 V

锥孔气流速：

35 L/h

Nanoflow气体压力：

0.2 bar

使用两种串联四极杆质谱仪（Xevo TQ-S和Xevo TQ-S micro）和两种四极杆正交加速飞行时间(oa-Tof)质谱仪（Xevo G2-XS QTof和SYNAPT G2-S-Si）进行MRM分析。采用至少三个MRM通道靶定内源性肽和标记的肽，每个色谱峰至少包含10个数据点。使用操作软件，根据色谱峰半峰高处的最小数据点数量自动计算串联四极杆驻留时间和扫描间隔延迟时间。串联四极杆质谱仪的碰撞能量设置为固定值，而飞行时间质谱仪的碰撞能量则设置为梯度。此外，执行基于飞行时间的MRM采集时，须手动设置积分和扫描间隔延迟时间。将碰撞能量设置为梯度增加，初始碰撞能量采用此回归公式计算：(0.034 x m/z) + 3.314 eV，此外，通过重复进样无基质的SIL肽样品评估CID碎裂效果，并据此进一步优化碰撞能量。

表1.串联四极杆和oa-Tof MRM实验的MRM通道概览。

结果与讨论

通量

采用两种LC平台监测十五种SIL肽均实现了最快的梯度分离，而且未引入同位素干扰。与纳升级LC设置相比，微流体接口能够以更高的流速工作，且接口数量更少。正因如此，系统体积清空的速度更快，从而可实现更快的梯度输送和色谱柱平衡。同时这也减弱了柱外体积（通常会导致谱带展宽）对分析的影响。在微流分离和纳升级LC分离的完整实验中，进样之间的运行周期分别为1小时和2小时，也就是说微流分离实验将通量提升了2倍。图2以其中一种SIL肽为例，展示了通量的增加。在上述梯度条件下，两种LC配置都获得了相似的峰容量（数据未示出）

图2.在Xevo G2-XS QTof上采用ionKey/MS和纳升级LC检测血清基质中柱上进样量为12.5 amol的LGPLVEQGR所得的结果。

灵敏度

采用纳升级LC-MS平台检测浓度水平为12.5 amol的各种SIL肽，并采用微流LC-MS平台检测浓度水平为125 amol的各种SIL肽，所得结果的峰到峰信噪比平均值相当，且四种MS平台上的实验结果均如此。图3展示了微流LC平台分别与串联四极杆和飞行时间MS平台连用时观察到的相似灵敏度。分析上述两种浓度水平的样品时，纳升级LC-MS平台的信噪比值在2~30范围内，微流LC-MS平台的信噪比值在2~100范围内。无论采用哪种MS平台，纳升级LC-MS平台的检测下限(LLOD)中位数和平均值都分别为5 amol和8 amol，而微流LC-MS平台的这两个结果分别为20 amol和39 amol，这表明纳升级LC的灵敏度约为微流LC的4倍。图5显示了四种纳升级LC-MS平台在检测所有SIL肽时，信噪比和检测限方面的平均灵敏度。

图3.将ionKey/MS分别与Xevo G2-XS QTof和Xevo TQ-S micro联用，分析血清基质中柱上进样量为62.5 amol的LGPLVEQGR所得的响应。
图4.ionKey/MS与四种不同MS联用的配置所得的线性比较(TGLQEVEVK)。
图5.使用Nano LC的MS-MS平台的平均线性和灵敏度。

线性

所有八个LC-MS平台的1/x加权结果均呈线性，且测试范围内所有SIL肽的r2回归相关系数值都为0.986或更高。图4展示了微流LC平台分别与四种MS平台联用分析目标SIL肽之一时的线性。图5以图表形式汇总了采用四种纳升级LC-MS平台分析所有SIL肽获得的平均r2回归相关系数，以及柱上进样量为12.5 amol时的信噪比和预估LLOD。

灵敏度和重现性

由于十五种SIL肽被加标至未分馏、未除高丰度的胰蛋白酶酶解人血清样品中，因此我们可在已测定的线性动态范围内对存在于基质中的内源性肽进行定量分析。  

对于总共八个LC-MS平台在该范围内检测到的所有肽，我们都计算了其平均浓度和相对标准偏差(%RSD)。图7展示了我们所研究的八种LC-MS配置的总体平均灵敏度/重现性之间的关系，此图确证了前文所述LC平台之间存在4倍灵敏度差异的结论，并展示了串联四极杆质谱仪的重现性优势。图6展示了采用各种LC-MS配置为各种肽单独测定的平均浓度以及平均相对标准偏差(%RSD)。

图6.在各种LC-MS平台上使用标准MRM设置分析六种候选肽生物标志物（fmol/200 ng基质）所得的定量结果汇总。插图通过各种LC-MS平台分析所得的%RSD值比较了其重现性。
图7.本实验分析的所有内源性肽的平均%CV和信噪比，显示了LC-MS配置的比较结果。

结论

相较于纳升级LC-MS平台，微流LC-MS平台能够提高通量，但我们必须在这种通量提升与纳升级LC-MS平台带来的更高灵敏度之间权衡。根据目标肽和所用LC-MS平台不同，微流LC-MS平台能够达到的检测限在3~250 amol。所有八个LC-MS平台在测量的范围内均表现出了优异的线性。重现性方面，所有八个LC-MS平台的%RSD值均低于16%，且串联四极杆LC-MS平台（尤其是Xevo TQ-S平台）的重现性比高分辨率飞行时间LC-MS平台更出色。 

综合考虑以上所有因素可知，微流LC平台与Xevo TQ-S串联四极杆质谱仪联用的系统可提高通量、重现性并扩展可用性，这些优势平衡了灵敏度方面相对微弱的下降，对于需要定量分析低浓度胰蛋白酶肽段的转化研究而言，该系统是理想之选。

参考文献

  1. Mbasu, et al.Advances in Quadrupole and Time-of-Flight Mass Spectrometry for Peptide MRM based Translational Research Analysis.Proteomics, in press.May 23, 2016.doi: 10.1002/pmic.201500500

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