• 应用纪要

采用配备PDA、QDa质谱检测器和Empower 3软件的ACQUITY Arc UHPLC系统分析农药制剂

采用配备PDA、QDa质谱检测器和Empower 3软件的ACQUITY Arc UHPLC系统分析农药制剂
  • Marian Twohig
  • Michael O'Leary
  • Neil J. Lander
  • Waters Corporation
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摘要

农药制剂中活性成分和所有其它组分（包括杂质和降解产物）的检测、表征以及定量为产品开发、质量控制和产品注册提供了必不可少的支持信息。配备光电二极管阵列(PDA)检测器的液相色谱(LC)技术被用于制剂样品的常规分析。增加质谱检测器与UV检测器联用可以提高分析检测方法的专属性和选择性，从而通过单次分析提供更多的样品信息。

在本应用纪要中，我们分析了一款市售农药制剂，其中含有两种活性成分(AI)，分别为杀虫剂AI 1和戊唑醇（AI 2，三唑类杀菌剂）。三唑类杀菌剂是一类常用的农药，对多种农作物疾病都有强效活性。

分析该制剂时，我们采用了UV和质谱检测技术，以及能够模拟HPLC和UHPLC分离的双流路液相色谱系统。ACQUITY Arc系统不仅能执行现有HPLC方法，还允许将方法转换为采用亚3 μm颗粒色谱柱的UHPLC方法，以实现更高效的色谱分离。

采用Empower 3软件进行数据采集和分析，并根据生成的结果标记出峰面积大于指定峰面积％的杂质。各种检测功能和数据分析方法相结合，可初步表征未知组分的结构。

优势

  • 利用PDA和质谱检测器提高杂质分析的可信度。
  • 通过单次分析即可鉴别结构相似的活性成分与未知组分。
  • Empower 3软件的数据分析和报告功能简便易用。
  • 可模拟HPLC和UHPLC分离的双流路设计有助于方法开发和转换。

简介

保护农作物是减小农作物损失、获取高质量食品并实现充足食品供应链的有效解决方案1。 对于农用化学品行业而言，农药产品的分析质量控制是确保产品送达客户时一致且有效的关键环节 2。 制剂中活性成分和所有其它组分（包括杂质和降解产物）的检测、表征以及定量为产品开发、质量控制和产品注册提供了必不可少的支持信息。配备光电二极管阵列(PDA)检测器的液相色谱(LC)技术被用于制剂样品的常规分析2-4。增加质谱检测器与UV检测器联用可以提高分析检测方法的专属性和选择性，从而通过单次分析提供更多的样品信息。 

在本应用纪要中，我们分析了一款市售农药制剂，其中含有两种活性成分(AI)，分别为杀虫剂AI 1和戊唑醇（AI 2，三唑类杀菌剂）（图1）。三唑类杀菌剂是一类常用的农药，对多种农作物疾病都有强效活性5。分析该制剂时，我们采用了UV和质谱检测技术，以及能够模拟HPLC和UHPLC分离的双流路液相色谱系统6。ACQUITY Arc系统不仅能执行现有HPLC方法，还允许将方法转换为采用亚3 μm颗粒色谱柱的UHPLC方法，以实现更高效的色谱分离。 

采用Empower 3软件进行数据采集和分析，并根据生成的结果标记出峰面积大于指定峰面积％的杂质。Empower的自定义字段可创建报告自定义计算的定制方法，从而根据检测结果生成更多信息。各种检测功能和数据分析方法相结合，可初步表征未知组分的结构。

图1.AI 1及戊唑醇的结构和m/z。

实验

仪器和软件

所有分离均采用配备2998光电二极管阵列(PDA)检测器和ACQUITY QDa质谱检测器的Waters ACQUITY Arc系统进行。使用Empower 3软件进行数据采集和数据处理。

  • 样品制备：称取市售农药制剂1 g，加入9 mL 50:50 (v/v)乙腈/水。将所得混合物超声处理20 min，然后使用注射式过滤器和0.2 µm PVDF滤膜将其过滤到自动进样器样品瓶中，准备进行样品分析。

 

LC条件

LC系统：

ACQUITY Arc

分离模式：

梯度

色谱柱：

CORTECS C18+ 3.0 x 100 mm, 2.7 μm

溶剂A：

0.1%甲酸的水溶液

溶剂B：

乙腈

流速：

0.80 mL/min

UV条件

UV检测器：

2998光电二极管阵列(PDA)检测器

PDA检测条件：

210~400 nm

柱温：

50 °C

进样体积：

5 μL

梯度条件：

0 min 20% B，10 min 80% B，11 min 90% B，12 min 90，然后返回初始条件。

MS条件

MS系统：

ACQUITY QDa

电离模式：

ESI+

毛细管电压：

0.8 kV

锥孔电压：

10 V

脱溶剂气温度：

600 °C

离子源温度：

150 °C

MS扫描范围：

100～1000 m/z

采样速率：

5 Hz

结果与讨论

杂质报告阈值

ACQUITY Arc系统采用Arc Multi-flow path™技术，能够提供可选的延迟体积。得益于此优势，该系统既能使用3.0 μm -5 μm颗粒色谱柱运行HPLC方法，又能使用2.5 μm - 2.7 μm颗粒色谱柱运行快速且高效的UHPLC分离方法，有效提升了色谱分离的灵活性，并最大限度提高了分析效率6。 我们使用CORTECS C18+色谱柱（3.0 x 100 mm, 2.7 μm实心核颗粒色谱柱，部件号186007402）在UHPLC模式下对农药制剂样品进行色谱分离。CORTECS 2.7 µm色谱柱可兼容HPLC和UHPLC仪器。这类色谱柱在HPLC背压下柱效极高，因此，与使用5 μm全多孔颗粒色谱柱的现有方法相比，其分析速度更快，分离度更高7。

值得注意的是，在完成农药制剂分析并使用Empower 3软件处理所得数据之后，我们发现有两种未知组分超过了Empower处理方法中设定的报告阈值0.1％8。 Empower报告（图2）显示了分离农药制剂样品所得的220 nm处的ACQUITY Arc UV谱图。软件已经鉴定出了两种活性成分，并且标记出了未知组分。色谱图下方的峰结果表显示了组分名称、峰面积、峰面积％、保留时间、杂质响应和报告阈值。UV和MS数据表明，未知物1和未知物2可能具有与戊唑醇AI相同的结构特征（图3），因此我们使用Empower 3的自定义计算功能来计算每种杂质相对于戊唑醇的峰面积％（图2中的表格）。  表格以红色突出显示了检出的杂质，因此我们很容易识别可能需要进一步研究的组分。

图2.Empower软件报告，显示了分离农药制剂样品所得的220 nm处的ACQUITY Arc UV谱图。峰结果显示在谱图下方，超过阈值的杂质以红色突出显示。报告中还显示了已知AI的结构。

将色谱、UV和质谱检测结果整合在Empower软件的同一窗口，进一步减轻数据解析负担。Empower质谱分析窗口（图3）特别提供了一个位置，可以将分析中所有检测器采集到的色谱峰与其对应的谱图相关联。该窗口将显示UV谱图、光谱图、总离子流色谱图(TIC)和质谱图，还将显示提取离子色谱图(XIC)。检出峰的光谱经时间校准后显示在色谱图上方的窗口中，便于分析人员快速审查数据。

图3.Empower软件质谱分析窗口：UV谱图、MS谱图、UV和总离子流色谱图(TIC)，以及提取离子色谱(XIC)都显示在同一个窗口中。

质谱分析窗口中显示的数据表明未知物2（峰3）和戊唑醇AI（峰4）之间存在关联。它们的UV光谱最大吸收值相近，且质谱图表明戊唑醇具有[M+H]+离子（对应m/z 308），而未知物2具有相同的m/z。此外，未知物2的同位素分布是典型的氯代化合物（参见图4），并且与AI的同位素分布相同。通过单次进样分析，我们鉴定出未知物2具有与戊唑醇相似的UV光谱，以及与之相同的m/z和同位素分布。这些结果表明未知物2可能是戊唑醇的异构体，并且可能具有与之相关的结构组成和化学性质。此外，质谱图中未知组分的检测灵敏度明显有所改善，尤其是从TIC中提取出目标峰对应的离子谱图之后。ACQUITY QDa对检测灵敏度的提升有效提高了数据评估的可信度。

未知物1（峰2）的UV最大值与未知物2和戊唑醇的UV最大值非常相近，这可能表明该杂质也与戊唑醇AI相关。未知物1的m/z为281，同位素分布表明其结构中存在氯元素（图4）。图4显示的Empower质谱指数图报告对数据进行了汇总。

图4.Empower质谱指数图报告，显示了分析农药制剂所得的220 nm处的ACQUITY Arc UV色谱图，不仅显示了检出峰的UV光谱（顶部谱图），还显示了ACQUITY QDa MS扫描色谱图（底部谱图）和UV检出峰的MS谱图。插图显示了两种AI的结构。

结论

  • ACQUITY Arc系统既能使用3.0 μm - 5.0 μm颗粒色谱柱运行HPLC方法，又能使用2.5 μm - 2.7 μm颗粒色谱柱运行快速且高效的UHPLC分离方法，有效提升了色谱分离的灵活性，并最大限度提高了分析效率6。
  • ACQUITY QDa质谱检测器与PDA检测器相结合，能够更加可靠地检测农药制剂中的低浓度组分。鉴定结果表明，杂质组分具有与制剂样品中的活性成分三唑类杀菌剂类似的光谱和结构性质。
  • 通过Empower软件质谱分析窗口这一个位置即可将分析中所有检测器采集到的色谱图与光谱图相关联。在同一窗口合并信息非常便于分析人员查看和解析数据。
  • 增加质谱检测作为互补性分析检测技术可提高化合物检测和鉴定的可信度。将ACQUITY QDa质谱检测器与分析人员熟悉的PDA检测器相结合，通过一种经济有效的途径成功地将质谱检测融入了之前依赖于低选择性检测器的实验室的常规分析中。
  • Empower 3拥有许多有助于数据分析的功能。该软件可以自动标记超过设定限值的杂质，还能通过定制计算快速生成相关信息，从而有效协助分析人员识别出可能需要进一步研究的组分。

参考文献

  1. EM Ulrich, CN Morrison, MR Goldsmith, WT Foreman.(2012).Chiral Pesticides: Identification, Description and Environmental Implications.Reviews of Environmental Contamination and Toxicology.Springer US.217: 1-74, 2012.
  2. Quality Control of Pesticide Products.(2009).Prepared by the Joint FAO/IAEA Division of Nuclear Techniques in Food and Agriculture.[cited January 8th, 2016) http://www-pub.iaea.org/MTCD/publications/PDF/te_1612_web.pdf
  3. KV Kumar, NVS Naidu.Development and validation of RP-HPLC method for the analysis of carbofuran and in its formulations.Der Pharma Chemica, 5(1): 313–319, 2013.
  4. L Vodeb, B Petanovska-Ilievska.HPLC-DAD with different types of columns for the determination of β-Cyfluthrin in pesticide formulations.ACTA Chromatographica.No. 17, 2006.
  5. L Toribo, MJ del Noza, JL Bernal, JJ Jimenez, C Alonso.Chiral separation of some triazole pesticides by supercritical fluid chromatography.J. Chrom.A. 1046: 249–253, 2004.
  6. Waters brochure: ACQUITY Arc System.Part no.720005393en.March 2016.
  7. Waters brochure: CORTECS 2.7 μm Columns. Part no.720004675en.February, 2015.
  8. Commission Regulation (EU) No 544/2011.(2011) [cited January 7th, 2016] http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2011:155:0001:0066:EN:PDF

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