使用ACQUITY UPLC H-Class和Xevo TQD液相/串联质谱仪进行水中药物和个人护理产品(PPCP)的多残留分析

许多已发表的文章都提到，在河流和溪流中存在万亿分之一(PPT)水平的PPCP。因此我们需要能够检测这些痕量化合物的方法。除了需要检测低水平的PPCP，该分析的另一个主要挑战在于化合物种类和结构广泛的化学多样性。另外，水样品的复杂性还要求分析方法能够适用于样品多种性。本应用纪要介绍了井水和地表水样品中78种PPCP(包括酸性化合物、碱性化合物和中性化合物)的提取、分离和检测。使用ACQUITY UPLC H-Class系统和小型台式Xevo TQD，仅通过单次进样就能分析所有的化合物。

应用优势

• 对具有广泛化学多样性的低浓度化合物进行提取和浓缩
• 使用单一的LC-MS/MS方法分离和检测PPCP
• 在亚万亿分之一范围内进行PPCP的定量分析

近年来，水体中存在的药物和个人护理产品(PPCP)¹残留在全世界范围内都受到了越来越多的关注。这些新型污染物对人类健康的影响以及它们对环境的潜在影响尚未被完全了解。随着人们的关注持续增长，全世界许多政府机构开始资助相关的研究，评估PPCP是否会导致有害的生态效应。

许多已发表的文章都提到，在河流和溪流中存在万亿分之一(PPT)水平的PPCP^2-7。因此我们需要能够检测这些痕量化合物的方法。除了需要检测低水平的PPCP，该分析的另一个主要挑战在于化合物种类和结构广泛的化学多样性，如图1所示。另外，水样品的复杂性还要求分析方法能够适用于样品多种性。本应用纪要介绍了井水和地表水样品中78种PPCP(包括酸性化合物、碱性化合物和中性化合物)的提取、分离和检测。

样品

收集了两个不同类型的水样品，分析前储存在4 °C条件下。此外，购买了含有低含量目标物PPCP的试剂级水样品进行对比分析以及作为空白对照。

试剂级水样品：LC-MS级纯水(Fisher Chemical，Optima牌)

井水样品：收集自当地的一个私人井水源

地表水样品：收集自当地的一个水库

样品制备

提取流程在Waters™ 6-cc Oasis MAX (部件号 186000369)和6-cc Oasis MCX (部件号186000256) SPE 的串联小柱上进行。这种配置能够实现反相、阴离子交换和阳离子交换三层提取机制。设计这种提取方案是为了确保酸性、碱性和中性的PPCP完全保留。Oasis MCX小柱连接在Oasis MAX小柱下面，二者都使用5 mL甲醇和5 mL水过柱进行了预平衡。使用适配器，利用真空，使水样品(1 L)以10 mL/min的流速上样到两个叠加的小柱上。一旦上样步骤完成，就将叠加的小柱分开。接下来要分别对每个小柱进行特定的洗脱步骤，流程如图2所示。Oasis MAX小柱使用5 mL 5%的铵水溶液进行淋洗。提取分两个步骤实施，首先用5 mL的甲醇进行提取(中性PPCP)，然后用5 mL含2 %甲酸的甲醇提取(酸性PPCP)。两次提取液都收集到同一个20 mL的玻璃管中。Oasis MCX小柱用2%的甲酸淋洗，然后用5 mL含2%氢氧化铵的甲醇进行提取(碱性PPCP)。混合MCX和MAX提取流份，在60 °C下，温和的氮气吹扫中蒸发至干。将干燥后的提取物复溶于900 μL(2 x 450 μL)10 mM的甲酸铵中。接下来添加内标混合物(100 μL)，使其达到1.0 ppb浓度。基质校准标准液通过同样的方案制备，只是对最终提取物的处理略有不同：将干燥后的提取物复溶于800 μL (2 x400 μL)10 mM的甲酸铵中，然后加入100 μL内标混合物。在不同浓度的PPCP的10 mM 甲酸铵溶液中，分别添加100 μL该溶液。所加入的大多数化合物标准品的浓度范围是0.1到5.0 ppb(0.1、0.2、0.25、0.5、1.0、2.0、2.5和5.0 ppb的终浓度)。该范围相当于初始样品中0.1到5.0ppt的浓度。有13种化合物的检测限较高，它们的分析范围是1.0到50.0 ppb(相当于样品中1.0到50.0 ppt的浓度)。这13种化合物分别是头孢氨苄、西诺沙星、可待因、皮质酮、双氯青霉素、红霉素、吉非罗齐、布洛芬、酮洛芬、萘普生、托芬那酸、去炎松和华法林。内标混合物由三种同位素标记标准品组成：西咪替丁-D3-N-甲基-D3、氯苯那敏-d6-马来酸盐-N,N二甲基-d6和吉非罗齐-d6-2,2二甲基-d6(购自C/D/N Isotopes Inc)。

LC-MS/MS

选择并优化了PPCP的两种MRM离子对(定量和确证)(表1)。这些结果被录入了Quanpedia™数据库，供我们自己和其它实验室未来进行研究时使用。对于本应用来说，由于PPCP具有广泛的化学多样性，为多残留分析找到最佳的色谱条件就成为了一个极大的挑战。使用2.1 x 100 mm ACQUITY UPLC HSS T3分析色谱柱(1.8 μm)时获得了最佳的色谱分离度。在分离大多数化合物时表现出最佳色谱性能的流动相由甲醇/10 mM甲酸铵水溶液(pH 3.2)组成。Optima LC-MS级甲醇和水购自Fisher Scientific。

尽管所分析的化合物具有广泛的化学多样性，我们仍然获得了总共82种化合物的优异色谱分析结果。不同种类化合物的色谱图如图3所示。本研究所涉及的82种PPCP中有78种能够通过双小柱SPE方法进行高效的提取。其中5种化合物(异羟基洋地黄毒甙、氟罗沙星、红霉素、6α-甲基强的松龙和甲苯磺丁脲)在使用该提取方案处理井水和地表水样品时的回收率较差，虽然它们在试剂级纯水中的回收率是可接受的。因此，在进行定量分析时我们排除了这些化合物。

为了确保该方法没有导致PPCP的残留或误检，我们检测了试剂级纯水空白样品，目的是找到可用作空白的洁净水源和创建校准标准品。通过筛查多个来源的样品，Optima LC-MS级纯水(Fisher Scientific)给出了最佳的结果。使用SPE方案对该试剂级空白水样品进行了浓缩。我们对提取后的该样品以及在提取后加入了PPCP的该样品进行了分析和比较。通过该试验可估计试剂级水样品中的背景水平，确定它是否完全不含目标PPCP。结果表明，试剂级水样品中只检测到四种含量在100 ppq水平以上的PPCP(表2)。这四种化合物是恩诺沙星、氟罗沙星、利福昔明和地尔硫卓。这些化合物被认为以100 ppq到1 ppt的水平存在于试剂级纯水样品中。检测试剂级纯水样品时，这四种化合物均未在1 ppt水平以上有所响应。在最低校准点以下检测到46种化合物，还有28种化合物没有在试剂级空白水样品中检测到。

图4展示了4种在试剂级纯水标准品中根本没有检测到的PPCP的MRM色谱图(定量离子跃迁)。试剂级空白纯水样品提取物以及添加PPCP后的试剂级纯水样品提取物被放在一起展示，对相当于未提取样品中0.1 ppt(100 ppq)的响应进行说明。

为了评估该方法的定量分析能力，选择了3种氘代化合物作为内标。除了试剂级纯水空白，还使用了井水样品和地表水样品来证明该方法在不同水基质中表现出的性能。在以3种氘代化合物作为内标的初始试验中，适用该提取方法的78种PPCP中的58种都获得了优异的定量结果。为了对其它化合物进行定量，还需要选择额外的内标进行进一步的研究。加标量为1 ppt的58种化合物的回收率如图5所示。对于含有适当内标的PPCP，R²值的范围在0.991到0.997之间(线性拟合，1/x加权)。所使用的内标和每种化合物的线性回归R²值如图3所示。

为了评估3种水样品的基质效应，将未进行提取的试剂级纯水样品中的标准品响应与加入了1 ppt PPCP的试剂级水样品提取物、井水样品提取物和地表水样品提取物中的标准品响应作了比较，结果如图6所示。试剂级纯水样品中大多数PPCP的基质效应小于20%。这清楚表明该水样品的洁净度很高。井水样品和地表水样品中一半以上PPCP的基质效应大于20%。地表水样品的复杂性显然较高，其中约三分之一化合物的基质效应大于50%，如图6中饼状图的橙色区域所示。优化提取方案的目的是使多种类型化合物的捕集效率最大化，因此对两种提取小柱都仅仅使用了温和的清洗方案，以确保在最终提取之前不会发生化合物穿透。使用这种温和的清洗方案时，与洁净的样品(如试剂级水样品)相比，我们预期复杂的水样品可能仍将表现出基质效应。为了处理复杂性较高的水样品，可以使用SPE方案进行额外的净化步骤。关于最适合的内标的进一步研究也将有助于应对较高的基质负荷。在其它试验2中，2种不同的地表水样品也表现出类似的效应。

该提取方法被用于评估井水样品和地表水样品中当前的PPCP水平。在井水样品中，在100 ppq水平以上，检测到2种PPCP：磺胺甲噁唑(0.97 ppt)和阿替洛尔(0.32 ppt)，而在该水平以下，检测到14种PPCP。在地表水样品中，在100 ppq水平以下检测到17种PPCP。图7分别列举了每个样品中所检测到化合物的示例。为了对空白样品进行说明，还展示了另一个样品中相同化合物的迹线，为了展示噪音水平，对图中的基线进行了放大

• 开发了一种针对多种PPCP(包括酸性化合物、碱性化合物和中性化合物)进行提取、浓缩和定量分析的方法。
• 使用ACQUITY UPLC H-Class系统和小型台式Xevo TQD，仅通过单次进样就能分析所有的化合物。
• 成功实施了灵敏的检测，达到了亚万亿分之一的检测限，并且使用该方法检测了地表水和井水样品中的残留。

1. http://www.epa.gov/ppcp/www.epa.gov/ppcp
2. A L Batt, M S Kostich, J M Lazorchak.Anal Chem.(2008), 80:5021–5030.
3. B J Vanderford, S S Snyder.(2006) 40:7312–7320.
4. S Reverte, F Borrull, E Pocurull, R M Marce.225–232.
5. J D Chahill, E Furlong, M R Burkhardt, D Kolpin, L G Anderson.171–180.
6. B Kasprzyk-Horden, D R Baker.1620–1631.
7. B Shao, D Chen, J Zhang, Y Wu, C Sun.8312–8318.