• 应用纪要

使用UPLC-MS/MS定量分析地表水和最终出水中低至ppq水平的天然雌激素和合成雌激素

使用UPLC-MS/MS定量分析地表水和最终出水中低至ppq水平的天然雌激素和合成雌激素
  • Euan Ross
  • Benjamin Wuyts
  • Angela Boag
  • Waters Corporation
  • 苏格兰水务公司
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摘要

雌激素通常用作避孕药或用于激素取代疗法，并会随最终出水的排放进入水环境中。据信，雌激素可扰乱鱼类的内分泌系统，对水环境系统产生不良影响。根据欧盟指令2013/39/EU，《水框架指令》(WFD,2000/60/EC)中新增了15种其他的优先物质。此次更新并未将17α-炔雌醇和17β-雌二醇纳入优先物质清单，而是将它们列入了观察清单，目的是收集更多有关从水环境中检出这两种化合物及其潜在风险的数据。

本应用纪要介绍了一种分析地表水和最终出水中雌酮、17α-炔雌醇和17β-雌二醇的方法。为达到欧盟针对这些化合物设立的苛刻LLOQ要求（千万亿分之一，ppq水平），本研究所用的分析方法结合了离线固相萃取(SPE)净化和预浓缩、大体积进样技术以及三重四极杆质谱。

优势

该方法具有以下应用优势：

  • 灵敏度高，可进行欧盟LLOQ水平的检测。
  • 目标分析物可实现基线分离，峰形良好。
  • 地表水和最终出水检测数据均具有良好的线性和重现性。
  • 可接受的SPE加标回收率和重现性。
  • 在没有同位素标记内标的情况下，使用标准加入法定量分析最终出水中检出的残留物。

简介

雌激素通常用作避孕药或用于激素取代疗法，并会随最终出水的排放进入水环境中1。 据信，雌激素可扰乱鱼类的内分泌系统，对水环境系统产生不良影响1。 根据欧盟指令2013/39/EU2，《水框架指令》(WFD,2000/60/EC)中新增了15种其他的优先物质3。此次更新并未将17α-炔雌醇和17β-雌二醇纳入优先物质清单，而是将它们列入了观察清单2，目的是收集更多有关从水环境中检出这两种化合物及其潜在风险的数据。 

本应用纪要介绍了一种分析地表水和最终出水中雌酮、17α-炔雌醇和17β-雌二醇的方法。为达到欧盟针对这些化合物设立的苛刻LLOQ要求（千万亿分之一，ppq水平）4，本研究所用的分析方法结合了离线固相萃取(SPE)净化和预浓缩、大体积进样技术以及三重四极杆质谱。

Xevo TQ-XS

实验

样品描述

萃取样品由苏格兰水务公司制备和提供。首先使用离线固相萃取(SPE)方法对加标地表水和最终出水样品进行过滤、萃取和浓缩5-6（图1）。挥干样品并复溶于LCMS级水中，执行大体积进样(100 µL)并通过UPLC-MS/MS进行分析。

图1.苏格兰水务公司提供的固相萃取、净化和浓缩方法

LC条件

液相色谱系统：

ACQUITY UPLC H-Class，配备用于大体积进样的扩充定量环、进样针和注射器

样品瓶：

TruView LCMS认证样品瓶

色谱柱：

ACQUITY UPLC BEH C18, 1.7 μm, 3.0 × 100 mm

柱温：

30 °C

样品温度：

10 °C

进样体积：

100 μL

流速：

0.6 mL/min

流动相A：

LCMS级水，含0.01 mM NH4F（分析纯）

流动相B：

50:50 LCMS级乙腈:甲醇，含0.01 mM NH4F（分析纯）

梯度

时间(min)

流速(mL/min)

%A

%B

初始

0.6

70

30

1.00

0.6

70

30

3.50

0.6

5

95

5.50

0.6

5

95

5.60

0.6

70

30

8.60

0.6

70

30

MS条件

MS系统：

Xevo TQ-XS

电离模式：

ESI

采集模式：

MRM

毛细管电压：

2.00 kV

锥孔气流速：

150 L/h

脱溶剂气温度：

600 °C

脱溶剂气流速：

1200 L/h

喷雾器压力：

7 bar

数据管理

MassLynx 4.2版
表1.目标分析物的理想MS参数和LC保留时间汇总

结果与讨论

通过评估各种色谱柱、流动相组成、梯度和MS通道进行方法优化。实验部分详细列出的条件是所测试的条件中总体性能最出色的。目标化合物实现了基线分离，50 ng/L溶剂标准品的色谱图示例如图2所示。由于分析物是疏水化合物，在梯度的高有机相部分洗脱，因此难以与本研究所用的最终出水样品基质组分分开，如图3的RADAR扫描结果所示（全扫描，m/z 100~1000）。为尽量避免MS离子源受污染，本研究使用Xevo TQ-XS上的集成流路系统将色谱区域转移到MS系统中进行分析，并将不需要的区域引至废液。 

图2.使用1.7 µm, 3.0 × 100 mm, ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱分离50 ng/L溶剂标准品得到的示例色谱图，进样体积100 µL。 
图3.经SPE净化并浓缩后的基质样品的RADAR扫描结果（全扫描，m/z 100~1000）。最终出水样品的RADAR扫描结果中对应地显示了目标化合物的示例峰，以指示其洗脱的区域。 

在适当的范围内，所有化合物的基质匹配（萃取后加标）分段校准曲线均表现出令人满意的线性。对于地表水样品，17α-炔雌醇在10~320 ng/L的浓度范围内线性良好，17β-雌二醇和雌酮则在62.5~2000 ng/L的浓度范围内线性良好（R²>0.998，残差<15%）。所有三种化合物的校准曲线及相关残差示例见图4。对于最终出水样品，三种化合物的基质匹配校准曲线范围均为120~2000 ng/L，且全都获得了可接受的线性（R²>0.997，残差<10%）。使用加标水样（各种类型的基质，n=8）评估方法稳定性，结果为%RSD低于6%。

为评估该方法分析地表水的性能，我们在萃取之前向基质样品中预先加标一定量pg/L (ppq)水平的标准品，然后按照图1所示的方法进行样品前处理。在净化和浓缩之前向地表水样品中预加标低ppq水平的标准品，所得的色谱分离结果和灵敏度示例见图5。 

根据溶剂校准曲线对后加标地表水样品进行定量分析，从而确定基质效应。经计算，17β-雌二醇和雌酮的基质效应≤-22%（抑制），17α-炔雌醇的基质效应≤16%（增强）。最终出水样品即使经过SPE净化之后仍然相当复杂，如图3中的RADAR扫描结果所示，导致所有化合物都受到显著的基质抑制(≤-72%)。不过，尽管基质抑制效应如此显著，仍然可检出各种低浓度化合物。

图4.地表水中所有化合物的校准曲线及相关残差(n=2)示例 
图5.预加标（萃取前）30 pg/L 17α-炔雌醇、120 pg/L 17β-雌二醇和400 pg/L雌酮的地表水样品的分析结果

在地表水样品中加标两种浓度的分析物并重复进样三次所得的回收率和重现性数据详细列于表2中。 

该方法表现出非常高的灵敏度，达到了欧盟(2015/495/EU)4针对地表水基质中各化合物规定的LLOQ (PtP s/n=10)水平。最终出水基质中的所有低浓度化合物都成功检出。采用标准加入法定量分析样品中的目标分析物，得到17α-炔雌醇的测定值为16.9 pg/L，如图6所示。

表2.向地表水基质中加标两种浓度的标准品并重复进样三次，得到的各分析物的SPE方法回收率和重现性（预加标浓度以粗体显示）。
图6.用于计算最终出水样品中低浓度17α-炔雌醇的标准加入法(n=2) 

结论

本文重点介绍了地表水和最终出水中低ppq水平合成雌激素的分析方法。运用Oasis SPE和Sep-Pak SPE样品制备技术的优化萃取方法能达到理想的浓缩和净化效果，使得加标地表水样品获得可接受的回收率和重现性。使用ACQUITY UPLC H-Class和Xevo TQ-XS结合大体积进样，能够在地表水分析中满足各项具有挑战性的检测要求。使用标准加入法能够准确定量最终出水样品中的痕量残留物。

参考资料

  1. Schwindt A, Winkelman D, Keteles L, et al.An Environmental Oestrogen Disrupts Fish Population Dynamics through Direct and Transgenerational Effects on Survival and Fecundity.Journal of Applied Ecology.2014.
  2. Directive 2013/39/EU of the European Parliament and of the Council of 12 August 2013 Amending Directive 2000/60/EC and 2008/105/EC in Respect of Priority Substances in the Field of Water Policy Text with EEA Relevance.August 2013.
  3. Directive 2000/60/EC of the European Parliament and of the Council of 23 October 2000 Establishing a Framework for Community Action in the Field of Water Policy.October 2000.
  4. Commission Implementing Decision (EU) 2015/495 of 20 March 2015 Establishing a Watch List of Substances for Union-Wide Monitoring in the Field of Water Policy Pursuant to Directive 2008/105/EC of the European Parliament and of the Council (Notified under Document C(2015) 1756) Text with EEA Relevance.March 2015.
  5. Ross E, Boag A, Todd H, Gatward N. 采用配备两维色谱2D LC技术的ACQUITY UPLC系统与Xevo TQ-S串联质谱分析地表水和原进水中的亚ppt级天然雌激素和合成雌激素. 沃特世技术简报. 部件号720005626ZH.2016年3月.
  6. Chang H. et al.Occurrence of Androgens and Progestogens in Wastewater Treatment Plants and Receiving River Waters: Comparison to Estrogens.Waters Research.45(2):732–740.2011.

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720006030ZH，2020年11月修订

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