选择用于生物治疗性蛋白质肽图分析的反相色谱柱

本应用纪要重点关注在生物治疗性蛋白质常规表征和分析中用于肽图分析的反相(RP)色谱柱选择注意事项。

本研究评价了10种截然不同的RP色谱柱，这些色谱柱在键合相特性、基质颗粒组成和粒径方面有所变化。  我们从中得到4种沃特世RP颗粒技术非常适用于肽图分析。这些色谱柱技术与其他技术的差别在于，其不仅能够为化合物分离提供较高的峰容量，在保留性和选择性方面也具有相当大的差异，有助于加快RP肽图分析分离方法的开发。

优势

• 并行比较10种反相色谱柱用于肽分离的性能
• 用0.1%三氟乙酸(TFA)或0.1%甲酸(FA)评价性能
• 探讨了使用UPLC、UHPLC和HPLC对肽进行反相LC分离的高峰容量、保留性和不同的选择性
• 肽图分析色谱柱选择建议

蛋白质肽图分析是一种基本工具，在采用蛋白质组学方法发现新型生物治疗性蛋白质，以及监测这些蛋白质在开发和商业化过程中的修饰和降解方面均有用武之地¹。 在开发可重现且信息丰富的肽图时，需要对酶解方案及所得肽的分离方法进行优化。在本应用纪要中，我们将重点关注在生物治疗性蛋白质常规表征和分析中用于肽图分析的反相(RP)色谱柱选择注意事项。这些分析采用光学（UV吸光度）检测技术、质谱(LC-MS)检测技术或两者皆有。本文所述色谱柱选择注意事项中大多数也可直接应用于基于LC-MS的蛋白质组学研究和合成肽纯度分析的色谱柱选择。 

本研究使用乙腈梯度和0.1%三氟乙酸(TFA)或0.1%甲酸(FA)离子对试剂，评价了10种截然不同的RP色谱柱，这些色谱柱在键合相特性、基质颗粒组成和粒径方面有所变化。通过分离肽混标以及参比单克隆抗体胰蛋白酶酶解物进行比较。性能评价指标包括峰容量和肽保留性。此外，还强调了在所选色谱柱之间观察到的若干选择性差异。

样品描述

将MassPREP肽混合物样品复溶于0.1%甲酸中，使各种肽的浓度达到约15 µg/mL。对美国国家标准技术研究所(NIST)单克隆抗体(NISTmAb)标准品RM 8671进行还原、烷基化（碘乙酰胺）处理，然后用胰蛋白酶酶解。临分析前将样品用1%甲酸按1:9的比率酸化。进样的mAb样品最终浓度约为0.1 mg/mL。

背景

肽图分析的分离非常复杂。例如，NIST单克隆抗体标准品(NISTmAb)的胰蛋白酶肽图由包含3个及以上氨基酸残基的50多种预测肽组成。此外，还存在大量低丰度修饰肽或降解肽、不完全和非特异性酶解肽以及自溶性胰蛋白酶肽。因此，需要分离的组分可能达到上百种，其中许多组分代表蛋白质结构的关键属性，并且必须在存在邻近洗脱肽的情况下，以近两个数量级高的载样量检测低丰度分析物。在这些分离中，另一个问题是给定肽的不同变体之间可能存在微小的分子结构差异，例如一种包含超过20个残基的肽中，单个氨基酸残基存在脱酰胺结构²。

鉴于上述挑战，如果色谱柱能够为梯度洗脱过程中分离的肽提供更窄的色谱峰，就有可能在这些复杂分离中取得成功。这一分离性能特性被称为“峰容量”(PC)，它是一个无量纲值，通过将分离的平均峰宽除以梯度长度来确定，一般来讲，PC可以视为与平均分离度成正比^3,4。 在本研究中，4σ峰容量根据以下公式确定：

其中t_梯度为梯度时间，w_h,avg为半峰高处平均峰宽。

这些PC值由一组具有相同内径(2.1 mm)和柱长(150 mm)的色谱柱（表1）测定。 

使用由表2所示组分组成的肽混标（MassPREP肽混合物）确定所有被评价色谱柱的峰容量值。该混合物包含具有不同大小和电荷的肽。肽标准品可以提供分离良好且基本上纯的肽，使用UV吸光度数据确定峰宽等适应性参数更加容易，有助于PC的确定。还通过目视评价NIST参比mAb (IgG1)的胰蛋白酶酶解物进一步评估了色谱柱性能。通过确定NIST参比mAb胰蛋白酶酶解物中选定肽（表3）的提取离子质量色谱图(XIC)的PC，更深入地解析了选定色谱柱的定量性能。与MassPREP肽混合物中存在的肽相比，这些肽代表的分子量范围更广泛。

肽标准品结果

使用10种色谱柱对MassPREP肽混合物进行基于0.1% TFA或0.1% FA的分离，所得色谱图和PC值的比较如图1-图4所示。TFA和FA是肽图分析实验中主要使用的离子对试剂。TFA在色谱性能（PC、保留性和基线噪音）方面的优势以及FA在MS灵敏度方面的优势已得到充分证明，使用表面带正电填料的BEH（亚乙基桥杂化）颗粒（沃特世将其称为CSH（表面带电杂化）颗粒）的色谱固定相结合FA以及FA与TFA混合流动相能够实现高PC分离^4,5。

如图2和图4中的图表所示，所有评价的色谱柱在包含TFA和FA的流动相中均对肽实现了高PC分离。而在两种流动相中，粒径为1.7 µm和2.5 µm的CSH C₁₈肽分析专用柱(130 Å)和CSH苯己基柱（130Å，粒径1.7 µm）提供的平均PC较高。与包含TFA的流动相相比，这项性能优势在包含FA的流动相中更加明显。 

各种肽的PC值因色谱柱而异。例如，使用FA流动相时（图3），BEH C₁₈肽分析专用柱(300 Å)和BEH C₁₈肽分析专用柱(130 Å)分析蜂毒肽得到的PC结果明显高于CSH C₁₈肽分析专用柱(130Å, 1.7 µm)得到的结果。但后者对其他七种肽得到的PC明显更高。在本例中，蜂毒肽是一种相当不寻常的肽，因为它包含四个强碱性残基(KRKR)的序列基序。可以合理地假设，这组强碱性残基使CSH色谱柱上存在显著的电荷排斥，从而导致有效孔径减小、受限扩散效应增加，对于分子量相当大的肽(2854 Da)，PC有所下降。与孔径为130 Å的BEH颗粒相比，在孔径为300 Å的BEH色谱柱上观察到蜂毒肽和烯醇化酶T37肽(2827 Da)的PC值略高，表明实际上可以观察到3 kDa肽的受限扩散效应。我们将进一步考察NIST mAb肽图分析结果中的孔径效应，并在本应用纪要后文进行说明。 

另一方面，不同色谱柱之间各种肽的PC差异可能与肽的特性（例如电荷、大小和疏水性）以及固定相特性（例如孔径、颗粒形态和键合相特性）有关。例如，当使用FA流动相时，在CORTECS T3, 120 Å固定相上观察到蜂毒肽的PC异常偏低，主要原因可能是颗粒表面与这种强碱性(pI = 12.1)肽之间发生次级离子相互作用。需要强调的是，在开发理想的肽分离方法时，这些色谱柱填料差异也可发挥优势。 

粒径也是改善PC的关键因素之一，即峰容量与粒径的平方根成反比。在评价的该组色谱柱中，两对色谱柱填充有不同大小，但孔径和表面化学性质相当的颗粒。其中一对色谱柱为粒径1.7 µm和2.5 µm的全多孔CSH C₁₈肽分析专用柱(130 Å)，另一对色谱柱为粒径1.6 µm和2.7 µm的实心核CORTECS C₁₈+色谱柱(90 Å)。这两对色谱柱得到的各种肽的PC值（图2和图4）遵循相似的趋势；因此，可以使用平均PC值来评估粒径的影响。对于CSH C₁₈色谱柱，粒径1.7 µm与2.5 µm相比，观察到在TFA和FA中获得的平均PC分别增加了11%和16%。同样，对于CORTECS C₁₈+色谱柱，粒径1.6 µm与2.7 µm相比，观察到在TFA和FA中获得的平均PC分别增加了17%和15%。两种情况下CSH C₁₈和CORTECS C₁₈+色谱柱的PC增加均分别低于其基于粒径的预测值21%和30%。这些差异可部分归因于本研究中小体积峰（约20 µL）的柱后扩散体积（管路和检测器流通池）、肽行为和分离条件变化以及色谱柱填充效率的影响。尽管如此，这些数据仍然表明较小的粒径可以显著提高PC。此外，还可以根据CSH C₁₈和CORTECS C₁₈+色谱图的比较推测，虽然使用实心核颗粒相比全多孔颗粒可能具有一些优势，但是在本例中，其他因素（例如表面化学性质）对色谱性能的影响可能更大。

mAb肽图分析结果

为专门解决肽图分析中填料颗粒表面电荷和孔径可能对PC的影响，将对还原和烷基化NIST mAb的胰蛋白酶解肽图中选定的肽进行评价（表3）。该样品使用TFA或FA离子对流动相生成的肽图紫外吸光度比较图如图5和图6所示。与之前有关肽标准品分离的观察结果（图1-4）一致，所有色谱柱均提供了出色的肽分离，在TFA和FA流动相中获得了足够高的峰容量和广泛的选择性。但由于此样品非常复杂，通过选定肽的提取离子色谱图(XIC)可以更好地解析各种分离的PC值。通过使用选择性检测器，可尽量减小未分离的肽对PC测定的影响。 

比较以TFA和FA为流动相，利用CSH C₁₈肽分析专用柱(130 Å, 1.7 µm)和BEH C₁₈肽分析专用柱(130 Å, 1.7 µm)获得的基于XIC的PC结果（图7和图8），所得结果证明了在CSH颗粒表面施加受控电荷的好处。这两种C₁₈ RP填料的粒径和孔径相当，并且基于相同的亚乙基和硅胶桥杂化颗粒(BEH)。此比较中值得注意的是，两种色谱柱均为各种大小和电荷的肽提供了高PC分离。以TFA作为离子对时，CSH色谱柱获得的PC比BEH色谱柱高10%；以FA作为离子对时，CSH色谱柱的PC高出20%。相对于BEH颗粒，CSH颗粒上的肽载样量更高，因此PC增加⁵。

为进一步评估孔径对肽分离的影响，对采用BEH C₁₈肽分析专用柱(130 Å, 1.7 µm)和BEH C₁₈肽分析专用柱(300 Å, 1.7 µm)得到的XIC进行了比较。这些XIC的叠加图见图9，结果图表见图10。此比较考虑了分子量大于1000 Da的肽。 

在比较这两种色谱柱获得的PC结果时（图10），观察到分子量大于1.8 kDa的肽在孔径为300 Å的色谱柱中PC略有提高。对于来源于mAb的大分子肽，这一色谱性能改善可能是受限扩散效应减小与300 Å孔径固定相所提供的可及比表面积增加相结合的结果。  

肽保留时间评价

在治疗性蛋白质标准品的肽图分析过程中可以监测的氨基酸序列百分比（即覆盖率）是一个重要的方法开发考虑因素。USP通则<1055>“生物技术提取产品 – 肽图分析”(Biotechnology-Derived Articles – Peptide Mapping)中提出，经验证肽图的目标序列覆盖率为95%或更高。因此，如果蛋白质酶解物产生大量亲水性肽，特别是在必须对其中一些肽进行定量才能监测关键质量属性(CQA)的情况下，可以使用肽保留性更高的RP色谱柱。 

本次评价计算了MassPREP肽混标中四种疏水性较弱的肽从各种目标色谱柱洗脱时的乙腈浓度。所示数据为含0.1% TFA（图11）和0.1% FA（图12）的流动相的结果。采用TFA和FA时，HSS T3肽分析专用柱(100 Å)在被测色谱柱中保留性最强。该固定相的键合相密度中等，被证明可促进保留⁶。使用TFA时，评价的所有色谱柱均提供了有效保留，使RASG-1肽获得了一定的保留。而CSH苯己基柱(130 Å)的保留性明显低于所有其他固定相。RASG-1肽的保留值得注意，因为尽管其分子较大(1000.49 Da)，但使用C₁₈色谱柱(100 Å)时，其疏水性指数(HI, SSRCalc, v Q, ©2006–2015, Manitoba Centre for Proteomics & Systems Biology)在TFA和FA中分别仅为4.40和0.54。疏水性指数为预测的乙腈浓度，在该浓度下肽的保留因子(k')为10.7。在评估FA中的保留时，HSS T3肽分析专用柱(100 Å)同样是保留性最强的色谱柱，而BEH C₁₈肽分析专用柱(130 Å)、BEH C₁₈肽分析专用柱(300 Å)和CORTECS T3色谱柱(100 Å)在这些条件下也为RASG-1提供了足够高的保留性。对于测试的其他色谱柱，RASG-1未充分保留以供分析。 

在开发用于分析治疗性蛋白质的肽图分析方法时，选择具有适当保留性的反相色谱柱需要考虑分离条件（例如，流动相和柱温）。除此以外，还有一个重要的考虑因素，即蛋白质酶解物的性质。特别是当所选的蛋白水解酶产生大量小分子亲水性肽时，使用保留性较强的固定相非常有用。但是，如果蛋白质酶解物产生大分子疏水性肽，使用保留性较强的固定相可能无法提供明显的优势。

肽选择性注意事项

不同固定相之间的选择性差异也可用于改善肽图分析分离方法，即通过调整一对关键的邻近洗脱肽的分离度来实现。但需要注意的是，在这些复杂的肽图分析分离中提高给定的关键肽对的选择性可能导致其他肽对之间的选择性损失。在提供的许多数据中均可观察到选择性差异，这可能是键合相类型、键合相密度、颗粒表面电荷和颗粒孔径等差异的结果。在这些变量中，键合相类型的变化对选择性的影响最显著。例如，图1比较了使用多种C₁₈固定相获得的MassPREP肽混标的分离结果。使用CSH苯己基固定相(130 Å)得到的分离结果显示峰8（烯醇化酶T37）与峰9（蜂毒肽）之间的洗脱顺序发生了变化。烯醇化酶T37在CSH苯己基固定相上的相对保留性更强可能是因为它含有大量芳香族氨基酸残基（酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸）。特别是T37肽中含有的连续苯丙氨酸的氨基酸基序可能与该固定相的苯基键合相形成很强的π-π相互作用。 

在具有相同键合相的固定相中观察到更细微的选择性差异；但是，除基质颗粒的特性（例如表面电荷和孔径）以外，键合相密度的变化也会影响选择性。这些差异的示例可通过比较还原和烷基化NIST mAb的胰蛋白酶酶解肽图中所选肽的XIC结果观察到。其中，对BEH C₁₈肽分析专用柱(130 Å)与BEH C₁₈肽分析专用柱(300 Å)、CSH C₁₈肽分析专用柱(130 Å)和HSS T3肽分析专用柱(100 Å)进行比较。为更好地显示这些选择性差异，已基于选定肽(H38)对齐色谱图时间轴。

BEH C₁₈肽分析专用柱(130 Å)与BEH C₁₈肽分析专用柱(300 Å)固定相之间的主要区别在于孔径和比表面积（185 m²/g和90 m²/g）。二者的键合相(C₁₈)与键合相密度(3.1 µmol/m²)均相当。因此，随着肽分子大小增加，观察到由体积排阻效应导致的选择性差异。这种效应在两种大分子肽L7和H15中更明显，预计在使用孔径为130 Å的介质时，它们会显著限制分析物进入孔。 

采用BEH C₁₈肽分析专用柱(130 Å, 1.7 µm)得到的分离结果与采用粒径相近的CSH C₁₈肽分析专用柱(130 Å)和HSS T3肽分析专用柱(100 Å)获得的分离结果比较见图14和图15。在BEH C₁₈肽分析专用柱(130 Å)与CSH C₁₈肽分析专用柱(130 Å)之间观察到的选择性差异可能是由于多种因素。这两种颗粒之间的主要区别在于，CSH C₁₈肽分析专用固定相表面施加了正电荷，C₁₈键合相密度也存在细微差异，CSH C₁₈肽分析专用柱固定相的C18键合相密度低约25%（分别为2.3 µmol/m²和3.1 µmol/m²）。值得注意的是，这两种固定相之间显著的表面电荷差异可以在肽（特别是净电荷存在显著差异的肽）的分离中提供潜在有利的选择性差异。 

在BEH C₁₈肽分析专用柱(130 Å)和HSS T3肽分析专用柱(100 Å)的比较中，观察到更细微的选择性差异。这些色谱柱在基质颗粒组成（BEH与硅胶）、键合相密度（3.1 µmol/m²和1.6 µmol/m²）、孔径（130 Å和100 Å）和比表面积（185 m²/g和230 m²/g）方面存在显著差异。这种广泛的差异使得难以预测肽选择性变化，因此通常需要进行经验比较，如此处所示。

用于生物治疗性蛋白质质量分析的色谱肽图分析方法必须为广泛的肽组提供足够高的分离度和回收率。可用于这些复杂分离的反相色谱柱有三个主要属性：峰容量、保留性和选择性。沃特世和许多其他制造商提供了大量色谱柱，难以从中选择合适的一款色谱柱用于肽图分析分离。此外，分析人员还必须考虑肽的许多不同特性（例如大小和电荷），以及流动相条件（TFA或FA）。实际上，没有任何单一色谱柱能够在任何条件下为各种肽对提供理想的分离效果。因此，色谱柱筛选很有必要。表4中列出了所有沃特世反相色谱柱及其属性的简要说明，这些色谱柱都有可能产生有效的肽图分析分离，可以在方法开发过程中进行筛选。但是，将所有这些色谱柱与其他制造商的选定色谱柱一起筛选是不可行的。因此，这些沃特世反相颗粒技术中的四个子集通常提供峰容量、保留性和选择性差异，能够实现反相肽图分析分离方法的成功开发，已被鉴定为肽分析专用填料（表4）。这些肽分析专用柱颗粒也经过质量检测，为肽分离的性能重现性提供了额外保障。 

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