固相萃取(SPE)、固液萃取(SLE)与液液萃取(LLE)样品制备技术在生物分析和法医毒理学分析中的全面分析比较

在本应用纪要中，我们通过生物分析和法医毒理学分析的血浆和尿液中发现的多种化合物，全面比较了包括SPE、SLE和LLE在内的样品前处理技术。

Oasis PRiME HLB对多种被测药物也表现出优异的回收率和较小的基质效应，且无需进行任何额外的方法开发。相比之下，SLE和LLE则需要额外的方法开发或多种萃取方案，才能让所有被测分析物的回收率达到与Oasis PRiME HLB相当。Oasis PRiME HLB的独特属性能够省略活化和平衡步骤，简化萃取步骤，加快样品制备流程。采用µElution板时无需蒸干或复溶，可直接注入萃取物进行分析。

优势

• 可比较生物分析和法医毒理学研究中不同样品前处理技术的过程和结果
• 萃取方案速度明显快于SLE和LLE
• 在处理血浆样本时，与SLE和LLE相比，Oasis PRiME HLB的分析物回收率更高，基质效应有所改善
• Oasis PRiME HLB在尿液样本中的分析物回收率高于SLE和LLE
• 与SLE（专属SLE板上固定样品量）相比，Oasis PRiME HLB可提供更灵活的样品容量选择

固相萃取(SPE)是一种样品前处理技术，用于从液态基质中（根据化合物的物理和化学性质）萃取溶解或悬浮的化合物。反相SPE吸附剂可以是聚合物或硅胶基质。在这两种情况下，化合物主要通过疏水相互作用保留在吸附剂上。清洗步骤有助于去除基质干扰物。分析物可以用有机溶剂洗脱，这类溶剂会破坏分析物与吸附剂之间的相互作用^1,2。Waters Oasis PRiME HLB是一种新型反相SPE吸附剂，可实现更简单、更快捷的SPE方案，同时通过简单、通用的三步方案获得比其他样品前处理方法更纯净的萃取物。

液-液萃取(LLE)采用不与水混溶的溶剂从水溶液中萃取分析物，萃取通常通过振摇并收集含有目标分析物的溶剂层来完成。

支撑液液萃取（SLE，又称固相载体液液萃取，SSLE）与传统的液-液萃取(LLE)类似，利用相同的不与水混溶的溶剂系统从水溶液中萃取分析物。与LLE中通过振摇不混溶的两种相进行混合的方法不同，在SLE中，水相样品被固定在惰性载体上，有机相流过支撑基质，以萃取目标分析物³。

本应用纪要展示了在生物分析和法医毒理学研究中，Oasis PRiME HLB SPE、SLE和LLE应用于血浆和尿液基质的比较研究。在血浆中，我们使用上述三种方法萃取了22种常规分析的药物、类固醇和滥用药物，并对结果进行了比较。在尿液中，我们对23种滥用药物进行了法医毒理学分析，其中涵盖了阿片类药物、兴奋剂、苯二氮卓类药物和合成大麻素代谢物的代表性药物。

比较的关键领域包括：程序简便性、分析物回收率和基质效应(ME)。同时，我们还讨论了这三种技术背后的机理，以及这些机理如何影响各自的性能。Oasis PRiME SPE对两种基质中的所有被测分析物均展现出了非常高且一致的回收率和出色的基质效应控制。对于SLE和LLE，在尿液样本中观察到极性碱性分析物回收率较低，在血浆样本中观察到酸性分析物回收率较低。随后，LLE和SLE方法针对这些专属性化合物进行了优化，成功提高了有问题分析物的回收率，但代价是牺牲了其他分析物的回收率。只有Oasis PRiME HLB能够使用单一方法成功萃取血浆和尿液样品中的所有分析物。

材料

RCS-4 M10、RCS-4 M11、JWH-073 4-COOH、JWH-073 4-OH和JWH-018 5-COOH购自Cayman Chemical（美国密歇根州安娜堡）。所有其他化合物和代谢物均购自Cerilliant（德克萨斯州圆石）。

各种储备液(1 mg/mL)采用甲醇、DMSO或50:50 DMSO/甲醇配制。使用甲醇制备所有化合物的混合储备液(5 µg/mL)，萘普生除外，其储备液为50 µg/mL。需每天将标准品加入基质（血浆和尿液）来制备工作溶液，并进行连续稀释以获得所需浓度。

本研究分析了血浆中包括酸性（萘普生）、碱性（大多数分析物）和中性（非那西汀、17-α-OH孕酮）在内的22种药物，这些药物用于多种应用领域。研究还检测了尿液中涵盖阿片类药物、兴奋剂、苯二氮卓类药物和合成大麻素代谢物的23种代表性滥用药物。

样品前处理方案

在本次评估中，与Oasis PRiME HLB配合使用的方案为通用的3步方案（上样-清洗-洗脱）。根据不同的基质，取400 µL血浆，以1:1的比例用4% H₃PO₄稀释，或取400 µL水解尿液，以1:1的比例用4% H₃PO₄稀释，然后直接上样到Oasis PRiME HLB µElution板上。无需对这两种基质进行活化或平衡。然后，用2 × 200 µL 5% 甲醇溶液清洗样品，再用2 × 25 µL的90:10乙腈:甲醇溶液进行洗脱。然后用100 µL水稀释洗脱液，涡旋混合后，直接进样至LC-MS系统，无需蒸发或复溶。

对于SLE，有多种建议的稀释缓冲液（用于稀释生物样品以进行上样）和萃取溶剂，具体取决于目标分析物。由于本研究的目的是比较针对所有化合物的单一方法，因此我们评估了成功可能性最高的方案。本次评估选择的方案专为中性和碱性分析物而设计，因为它们在混合物中占大多数。对于血浆样品，将400 µL稀释血浆（200 µL大鼠血浆 + 200 µL水）上样到SLE板中（购自竞争供应商，专为400 µL上样量而设计）。开始上样时，略微施加真空（约3 psi）2~5 s，等待5 min，待样品完全吸附到支撑基质上。接着加入800 µL的萃取溶剂（MTBE：甲基叔丁基醚），让溶剂在重力作用下流过基质5 min，以开始萃取分析物。再次施加真空(10 psi)持续10-30 s，完成洗脱。然后再加入800 µL MTBE，重复萃取步骤。为确保与LC-MS分析兼容并浓缩分析物，将萃取物在40 ℃的N₂气流下蒸干，然后复溶于200 µL的30%乙腈溶液中。对于尿液样本，我们使用了两种类似的预处理方案。取200 µL水解尿液，用水或0.5 M NH₄按1:1的比例稀释。然后将样品上样到SLE板上，并按照上述血浆样品方法处理。

对于LLE，实验使用单个2 mL离心管进行。由于LLE和SLE的机制相似，因此采用的方案也相似。在LLE实验中，将1000 µL MTBE加入400 µL稀释的血浆或水解尿液中。与SLE一样，血浆样品使用200 µL的水稀释。将200 µL水解尿液样品用200 µL水或200 µL 0.5 M NH₄OH稀释。随后将样品涡旋5 min，然后在11000 rcf下离心5 min。将上层液体转移至收集板中，在40 ℃的N₂气流下蒸干，然后复溶于200 µL的30%乙腈(ACN)溶液中。

所有样品/技术的尿液水解步骤如下：取200 µL加标尿液与160 µL水和40 µL β-葡糖醛酸酶（Roche，大肠杆菌）在室温下水解30 min，模拟酶水解过程。

回收率和基质效应计算

分析物回收率按照以下公式计算：

%回收率 = (峰面积A/峰面积B) × 100%

其中，A = 所萃取样品的峰面积，B = 萃取基质样品（萃取后加入化合物）的峰面积。

基质效应按照以下公式计算：基质效应 = ((存在基质时的峰面积/无基质时的峰面积)^-1) × 100%

存在基质时的峰面积是指在基质中添加化合物后的萃取基质样品的峰面积。无基质时的峰面积指在纯溶剂溶液中分析物的峰面积。

色谱分析

图1展示了使用20 ng/mL萃取血浆样品获得的所有化合物的代表性色谱图。图2展示了尿液的代表性色谱图。采用CORTECS UPLC C₁₈色谱柱(90Å, 1.6 µm, 2.1 × 100 mm)，所有分析物均在6.5 min内完成分析。所有化合物的峰形良好，无明显的拖尾或不对称，且在5%基线处的所有峰宽小于3 s。所有可能的干扰化合物，如甲基安非他命和苯丁胺，共有一个MRM通道(150>91)，均实现了基线分离。

图3中详细展示了SPE、SLE和LLE的萃取方案和处理时间。制备96份血浆样品所需的总时间为：Oasis PRiME HLB 15 min、SLE 40 min、LLE 60 min。Oasis PRiME HLB采用了一种简单、通用的三步SPE技术，无需蒸发和复溶（采用µElution板）即可去除盐、蛋白质和磷脂，而SLE和LLE则需要针对不同类别的分析物开发各自的方法，包括不同的样品预处理或萃取溶剂。上样后，SLE需要等待5 min，使样品完全吸附到支撑基质上。此外，在加入萃取溶剂后，还需要等待5 min，让分析物与萃取溶剂充分作用。由于萃取步骤中使用的溶剂与水无法混溶，因此在进行LC-MS分析时需要蒸干并复溶。此外，在SLE的上样步骤中，需通过施加非常温和的真空（约3 psi）2~5秒来启动液流，这是一步精细操作，需要时间和练习才能完善。如果启动时间过短（少于2~5 s）或压力过低，水相样品将无法成功固定到吸附剂上。如果时间过长或压力过高，血浆样品将直接洗脱，导致洗脱溶液浑浊，基质效应因子升高。在SLE和LLE中，使用不与水混溶的强萃取溶剂也可能从筛板和样品板中萃取杂质，进而污染萃取溶液。MTBE等萃取溶剂也会对操作人员的健康和环境产生不良影响。

使用简单的三步式SPE方案，Oasis PRiME HLB对所有被测分析物均表现出优异且一致的回收率（图4A），平均回收率百分比为98 ± 8%。所有测试的回收率均在75%~110%的范围内。SLE对中性和碱性药物的回收率良好，但对酸性分析物（如萘普生和合成大麻素JWH-073的COOH代谢物）的回收率较差。平均回收率为89 ± 7%。LLE的所有分析物回收率均低于80%，平均回收率为70 ± 10%。实验过程中只进行了一次萃取，这可能会导致了萃取效率的降低。进行第二次萃取可能会提高回收率，但也会增加处理时间。之前的研究也表明，额外的萃取可能会导致基质效应增加。对于SLE和LLE，选择了针对中性和碱性分析物的萃取方法。酸性分析物（如萘普生JWH-073, 4-COOH和JWH-018, 5-COOH）的回收率极低（回收率低于30%）。SLE或LLE需要进一步的方法开发或单独的方案以提高酸性分析物的回收率，例如采用不同的样品预处理方式或缓冲液。但是，这可能会对碱性药物的回收率产生不利影响。在这些条件下，只有Oasis PRiME HLB能够使用单一方案萃取全部碱性、中性和酸性化合物。

Oasis PRiME HLB的总体基质效应低于SLE或LLE（图4B）。Oasis PRiME HLB的所有基质效应均<20%，而SLE处理的17/22种药物和LLE处理的7/22种药物的ME均大于20%。Oasis PRiME HLB的平均基质效应仅为6%，而SLE为26%，LLE为16%。此外，LLE的基质效应变化较大。对于基质效应标准偏差值，SPE为1.4%~8.8%，SLE为1.9%~10.3%，LLE为2.6%~28.3%。Oasis PRiME HLB的三步方案中去除了盐、蛋白质和磷脂，获得了非常洁净的最终萃取物，对所有不同类别的22种药物的基质效应均最小。在SLE萃取物中观察到较高的基质效应，可能是从SLE吸附剂中萃取的杂质所导致，因为在使用相同样品和萃取溶剂的LLE萃取物中未观察到这种情况。或者，也可能只是因为SLE比LLE萃取效率更高。由于LLE在从尿液中萃取分析物方面似乎更为有效，它还可能萃取出其他可能导致离子抑制的组分。

总体而言，当样品基质中含有多种化合物时，Oasis PRiME HLB表现出优异的回收率，且基质效应最小。在本例中，样品包括酸（萘普生和合成大麻素代谢物）、碱（大多数药物）和不同极性的中性化合物。SLE对中性和碱性分析物的回收率在可接受范围内，但基质效应明显更高。由于LLE的萃取效率有限，其回收率较低（回收率相较SPE和SLE低10%~20%）。LLE还表现出较高的基质效应差异，特别是对于氟硝西泮和普萘洛尔这类化合物。使用SLE或LLE萃取时，酸性分析物无法通过单一程序高效回收，需要开发额外的方法来提高酸性分析物的回收率。

尿液样品

本研究使用SPE、SLE和LLE对一系列包括了兴奋剂、阿片类药物、苯二氮卓类、苯甲酰芽子碱(BZE)和合成大麻素代谢物在内的23种滥用药物进行了水解和萃取。如图5所示，使用Oasis PRiME HLB通用3步方案获得了一致的高回收率。检测的21/23种药物的回收率>75%，总体平均回收率为86% ± 6.6%。SLE和LLE萃取采用两种萃取方案，如材料和方法部分所述。用水稀释样品时（图5A），SLE对多种药物均显示出良好的回收率，但亲水性碱性化合物（如大多数胺类兴奋剂和去甲芬太尼）除外（回收率低于60%）。LLE显示出与SLE相似的趋势，但回收率要低得多。在用0.5 M氨水将尿液样品的pH调节至11后，进行SLE和LLE萃取，极性胺的回收率显著提高（图5B）。然而，这是以牺牲酸性更高的化合物（例如JWH-073和JWH-018的羧基代谢物）为代价的。与Oasis PRiME HLB不同，SLE或LLE的单一方案无法以可接受的回收率从样品中萃取出所有分析物。

Oasis PRiME HLB、SLE和LLE的基质效应大致相当（图6A）。SPE、SLE和LLE的基质效应绝对平均值分别为12、12和17，均在可接受范围内。使用这三种萃取技术中的任何一种，大多数化合物的基质效应均在20%以内。用氨水调节尿液pH（图6B）后，SLE的平均基质效应增加到了25%，而LLE的基质效应仍然相对较低，平均绝对值为14%。

在本应用纪要中，我们通过生物分析和法医毒理学分析的血浆和尿液中发现的多种化合物，全面比较了包括SPE、SLE和LLE在内的样品前处理技术。在法医毒理学分析中，Oasis PRiME HLB采用简单的三步方案，与SLE方案和LLE方案相比，该方案的萃取时间缩短了60%和75%。Oasis PRiME HLB对多种被测药物也表现出优异的回收率和较小的基质效应，且无需进行任何额外的方法开发。相比之下，SLE和LLE则需要额外的方法开发或多种萃取方案，才能让所有被测分析物的回收率达到与Oasis PRiME HLB相当。Oasis PRiME HLB的独特属性能够省略活化和平衡步骤，简化萃取步骤，加快样品制备流程。采用µElution板时无需蒸干或复溶，可直接注入萃取物进行分析。

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