使用高分辨率质谱对湖水样品中的微囊藻毒素进行靶向及非靶向筛查

摘要

本应用纪要介绍了将LC与高分辨率质谱(HRMS)联用对湖水样品中的微囊藻毒素进行靶向筛查的方法。

优势

筛查水样中低于法规限值的目标微囊藻毒素。
使用同一数据集进行定性和定量分析。
轻松生成全面的HRMS谱库。
可审查历史数据。

简介

因有害水华造成湖泊封闭的情况在夏季经常发生。最近的数据显示，美国至少有43个州都曾发生过有害水华导致人类或动物患病甚至死亡的事件¹。 2016年8月，美国至少有19个州发布了针对CyanoHABS的公共健康公告¹。这些水华由肥料流失、动物饲养场和化粪池系统泄漏产生的磷和氮径流引起。有人认为，全球变暖引起的夏季气温升高导致了藻类爆发。蓝绿藻会产生微囊藻毒素，这类环状七肽肝毒素由淡水环境中某些种类的蓝细菌产生。微囊藻毒素-LR是最常见的微囊藻毒素，其结构如图1所示。这些次级代谢物对高等生物有毒，会导致人类患病，在某些情况下甚至会致死²。由于它们在淡水和微咸水环境中产生，因此可能污染饮用水。与此相关的公共健康公告可能引起民众恐慌，还会导致州和市政经济因旅游收入损失而受到负面影响，例如2014年俄亥俄州托莱多就曾遭遇过这种情况，2016年7月佛罗里达州的海滩关闭事件也是一个例子。

图1.微囊藻毒素-LR的化学结构。

许多国家都采用WHO指导限值作为微囊藻毒素-LR的监管标准，其规定饮用水中的临时指导限值为1 µg/L，景观水中总微囊藻毒素-LR（游离态加上细胞结合态）的暴露限值为10 µg/L³。一些国家/地区特别规定了饮用水中微囊藻毒素-LR的限值，例如澳大利亚和加拿大的限值分别为1.3 µg/L和1.5 µg/L。市场上可购得的微囊藻毒素标准品非常有限，而文献中报道的不同微囊藻毒素变体已有将近100种。这些变体通过取代七种氨基酸产生。图2所示为微囊藻毒素可能的取代物。随着法规不断变化，同时鉴于其他微囊藻毒素也可能具有与受监管的LR相似的毒性，开发用于分析这些化合物的靶向和非靶向方法非常重要。

图2.如图所示，通过取代七种氨基酸可产生100多种不同的微囊藻毒素变体。

本应用纪要介绍了将LC与高分辨率质谱(HRMS)联用对湖水样品中的微囊藻毒素进行靶向筛查的方法。使用含11种微囊藻毒素以及鱼腥藻毒素A的混合标准品作为阳性鉴定的参考物质。除了分析样品之外，还绘制了微囊藻毒素-LR的标准曲线用于定量分析。通过单次分析同时采集母离子和碎片离子的准确质量数数据，并结合高质量UPLC分离以确认目标化合物。由于采用数据非依赖型方法采集数据，我们还可以对初始分析时未考虑在内的其他化合物进行研究。

实验

本研究的水样采集自美国的湖泊，筛查了UNIFI科学数据库中的12种目标化合物。通过运行混标生成数据库，其中包括各目标化合物的结构信息、分子式和保留时间。此外，运行0.1～50 µg/L的微囊藻毒素-LR标准品（溶于HPLC级水）以绘制标准曲线，用于样品定量分析。使用全谱采集以及高/低碰撞能量交替的模式(MS^E)采集数据。这种数据采集方法让我们能够基于结构信息确认是否存在目标化合物。

样品描述

样品采集自2016年据报道发生过有害水华的美国湖泊。所采集的样品包括湖水样品、码头旁的水样以及浮沫层样品。将样品裂解（冷冻/解冻），过滤，并在分析前进行稀释。进样前用水将样品稀释10倍。

UPLC条件*

UPLC系统：	ACQUITY UPLC I-Class
色谱柱：	ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 μm, 2.1 x 100 mm
柱温：	35 °C
样品温度：	8 °C
流速：	0.450 mL/min
进样体积：	1、5和10 µL
流动相A：	0.1%甲酸水溶液
流动相B：	0.1%甲酸的乙腈溶液
总运行时间：	12 min

*该UPLC方法由沃特世建立且此前已发表⁴。

梯度：

最低	流速(mL/min)	%A	%B
初始	0.45	98	2
0.80	0.45	98	2
9.00	0.45	30	70
9.05	0.45	10	90
9.90	0.45	10	90
9.91	0.45	98	2
11.50	0.45	98	2

质谱条件

质谱系统：	Xevo G2-XS QTof
电离模式：	ESI+
碰撞能量(LE)：	4 eV
碰撞能量（HE梯度）：	25~80 eV
扫描时间：	0.25 s
采集范围：	50~1200 m/z
毛细管电压：	1.5 kV
采样锥孔电压：	36 V
离子源温度：	120 °C
离子源补偿：	50
脱溶剂气温度：	500 °C
锥孔气流速：	150 L/h
脱溶剂气流速：	1000 L/h
锁定质量数参比化合物：	亮氨酸脑啡肽(556.2766 m/z)

数据管理

MassLynx 4.1版质谱软件和UNIFI科学信息系统

结果与讨论

美国湖水样品的鉴定结果

通过运行标准品确定UPLC方法的保留时间，标准品以HPLC级水制备，含所有12种标准品，浓度为10μg/L。将所得的保留时间与分子式和可用结构信息一起添加到UNIFI科学数据库中。利用UNIFI数据库解析高度复杂的数据集，从而鉴定12种目标化合物。为确保系统性能达到预期，除了采集目标样品数据之外，实验还采集了上述混标的数据。图3A所示为标准品进样的结果。图3B所示为标准品中检出的12种化合物的提取离子流色谱图叠加图。标准品数据表明保留时间偏差非常小，而且各目标化合物的质量误差都在5 ppm以内。

图3A.标准品（以HPLC级水制备，浓度为10 µg/L）的分析结果，所有12种目标化合物的质量误差都在5 ppm以内；3B.10 µg/L微囊藻毒素标准品的叠加色谱图。

确定系统性能符合预期之后，接下来运行四个样品。各样品的进样量为1 µL。原始数据由 UNIFI 软件进行一次组分化和处理⁶。本研究采用用户自定义的筛选器查看目标数据（图4）。该筛选器根据标准品数据质量进行定义，仅显示质量误差在5 ppm以内、保留时间误差在0.1 min之内且响应大于最小值的检出化合物。分析人员可将这些用户自定义的筛选器与他们想要查看的数据以及之前保存的数据相结合，从而采用同一工作流程实施进一步的数据审查。UNIFI的筛选器、视图和工作流程让分析人员能够采用自己的方案解析数据，还有助于数据审查方式的标准化。

图4.UNIFI中用于显示目标数据的筛选标准示例。本例仅显示了检出物质中质量精确、保留时间一致且响应高于100的微囊藻毒素。

各样品的结果如图5a、5b和5c所示。各图均以其中一个鉴定结果为例，展示了分析人员实现结果可视化的方法。使用非靶向数据采集的优势之一是能够测定不同电荷态的目标化合物。微囊藻毒素常常会形成多电荷态物质，如果预定义的分析方法仅针对一种物质，则可能遗漏多电荷态的分析物。在本例中，单电荷态及多电荷态物质均得以检出。通过在单次运行中同时采集高能量和低能量数据，有助于我们轻松确认目标化合物。软件会自动使用高能量数据执行碎片离子与目标化合物的结构匹配。图6所示为用于确认湖水样品中微囊藻毒素-LR的高能量和低能量谱图，以及基于化合物结构进行的模拟碎裂。

图5A.湖水样品的结果汇总；5B.码头样品的结果汇总；5C.浮沫样品的结果汇总。

图6.用于确认湖水样品中微囊藻毒素-LR的高能量和低能量谱图，以及基于化合物结构进行的模拟碎裂。

微囊藻毒素-LR的定量分析

除了分析样品之外，我们还绘制了微囊藻毒素-LR的标准曲线，用于测定样品中该物质的浓度。图7a所示为0.1～50 µg/L微囊藻毒素-LR的标准曲线，图7b所示为0.1 ppb微囊藻毒素-LR的色谱图。Xevo G2-XS QTof在较宽的检测动态范围内具有优异的质量精度（表1），表明该仪器适合用于测定实际样品中法规限值水平的微囊藻毒素。该结果还表明，即使在低浓度下，系统的质量精度仍然非常出色，能够提高定量数据的可靠性。所得数据表明Xevo G2-XS QTof具有高灵敏度，可用于定量分析法规限值水平的低浓度分析物。比对标准曲线评估样品并考虑稀释倍数时，样品中微囊藻毒素的浓度比景观水的行动限值高出了100倍（表2）。在饮用水中，污染物的浓度是污染源处污染物浓度的一部分。在本例中，为了进一步降低检测限，我们使用了2D UPLC系统。这类系统支持进样大体积水样，可达到更低的检测限5。

图7A.微囊藻毒素-LR的标准曲线，校准范围为0.1 µg/L～50 µg/L；7B.溶于HPLC级水中的微囊藻毒素-LR的色谱图，浓度为0.1 µg/L，进样体积10 µL。

表1.根据微囊藻毒素-LR的标准曲线得到的计算结果（校准所用样品采用HPLC级水制备），所有浓度下的质量精度都不超过4 ppm。

表2.样品中微囊藻毒素-LR的浓度计算值（景观水的限值为10 µg/L）。

适应法规变化

首次采集数据时，UNIFI科学数据库中并不包括微囊藻毒素-RR。为了展示QTof系统区别于传统串联四极杆分析的历史数据审查功能，我们使用相同的UPLC方法采集了微囊藻毒素-RR标准品的数据并将其添加到科学数据库中。使用串联四极杆MS系统时，分析人员必须预先定义MRM通道，无法对原始方法中没有包含的化合物进行数据审查。通过运行标准品将化合物添加到数据库中的方法并非始终可行，因为有时我们并没有可用的标准品。在没有可用标准品的情况下，分析人员可以将化合物结构导入数据库中，并通过搜索文献来评估该结果的相对保留时间。图8所示为采集到的标准品谱图，其中显示了主要的双电荷态物质。接下来，重新解析样品数据以确定是否存在微囊藻毒素-RR。码头和浮沫样品中都检出了显著水平的微囊藻毒素-RR。图9所示为这两个样品的提取离子流色谱图以及所得的微囊藻毒素-RR质谱图。这些数据被用于检测和确认这种附加化合物。当景观水中出现新兴的化合物时，采用该方法可以研究历史数据中是否存在新兴化合物。

图8.本研究采集的标准品谱图，其中展示了微囊藻毒素-RR的主要双电荷态物质。

图9.码头水样和浮沫样品中微囊藻毒素-RR的提取离子流色谱图和所得的质谱图。

结论

确认了湖水样品中的三种微囊藻毒素，其浓度均高于法规限值。
使用HRMS进行的检测和定量表现出优异的灵敏度，即使采用小体积进样和一维色谱也是如此。
将ACQUITY UPLC I-Class系统和Xevo G2-XS QTof与UNIFI科学软件相结合，成功满足了筛查微囊藻毒素的法规要求。
借助历史数据审查功能可对同一数据集再次进行鉴定，这是HRMS相较于串联四极杆分析的一大优势。

参考资料

USGS报告：“Cyanobacterial HABs (CyanoHABs) and USGS Science Capabilities”。2016年。
美国环境保护署水务办公室4304：“Cyanobacteria and Cyanotoxins: Information for Drinking Water Systems (EPA-810F11001).”2012年7月。
世界卫生组织(WHO)：Guidelines for Drinking Water Quality 4th edition，2011。
Oehrle SA等人。Detection of various freshwater cyanobacterial toxins using ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry.Toxicon 55: 965–972, 2010.
C Mallet.使用基于2D-LC技术的ACQUITY UPLC系统分析瓶装水、自来水和地表水中的微囊藻毒素RR、LY和YR。沃特世应用纪要编号720005249ZH。2014年12月。
G Cleland等人。利用HRMS对菠菜样品进行农药定性筛查和二元比较。沃特世应用纪要编号720005608ZH，2016年02月。