• 应用纪要

在临床研究中使用UPLC-MS/MS分析血清雌激素

在临床研究中使用UPLC-MS/MS分析血清雌激素
  • Robert Wardle
  • Lisa J. Calton
  • Waters Corporation
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仅供研究使用，不适用于诊断。

摘要

本应用纪要介绍了一种使用Waters ACQUITY UPLC I-Class系统和CORTECS苯基柱从血清中萃取和分析E2和E1，然后使用Xevo TQ-XS质谱仪进行质谱检测的临床研究方法

优势

  • 采用简单的液/液样品萃取方案，无需衍生化
  • 优异的分析灵敏度，可以区分空白样品与1 pg/mL加标的经处理血清样品
  • 所需样品量仅为250 µL

简介

17 â-雌二醇(E2)和雌酮(E1)是非妊娠人体内的两种主要生物活性雌激素。E2主要由卵巢和睾丸通过睾酮芳香化生成，而E1主要通过雄烯二酮的衍生化生成。E2可以代谢为E1，E1也可以转化为E2，因此研究人员需要测定这两种化合物。

该分析最大的难点在于，某些临床研究应用需要测定浓度极低的E2和E1。目前使用的某些免疫分析技术灵敏度不佳且缺乏普适的选择性，而已发表的LC-MS/MS方法样品用量大、样品萃取方法复杂，通常都包括衍生化步骤。

本文介绍了一种从血清中萃取并分析E2和E1的临床研究方法。该方法使用CORTECS苯基柱和Waters ACQUITY UPLC I-Class系统对提取后的样品进行色谱分离，然后使用Xevo TQ-XS质谱仪（图1）进行质谱检测。

图1. Waters ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQ-XS系统

实验

UPLC条件

系统：

配备色谱柱管理器的ACQUITY UPLC I-Class (FTN)系统

进样针：

30 μL

色谱柱：

CORTECS苯基柱2.7 μm, 2.1 × 50 mm（部件号:186008319）

流动相A：

0.05 mM氟化铵水溶液

流动相B：

甲醇

进样针清洗溶剂：

80%甲醇水溶液

清除溶剂：

10%甲醇水溶液

柱温：

50 °C

进样体积：

20 μL

流速：

0.3 mL/min

梯度：

见表1

运行时间：

4.75 min
表1. 分离E2和E1的梯度表

质谱条件

系统

Xevo TQ-XS

分辨率

MS1 (0.7 FWHM)

MS2 (0.7 FWHM)

采集模式：

多重反应监测(MRM)（详见表2）

极性

ESI -

毛细管

2.2 kV

离子源温度

150 °C

脱溶剂气温度

600 °C

驻留时间

0.05 s

数据管理

MassLynx软件4.2版自带的TargetLynx XS应用管理软件

初始条件下的操作背压约为3000 psi。

表2. E2和E1定量离子、定性离子及其内标的MRM参数

样品前处理

E2和E1认证参比溶液及其稳定标记内标(13C3)购自Cerilliant公司（美国德克萨斯州圆石）。使用购自Golden West Biologicals（美国加利福尼亚州特曼库拉）的替代基质MSG4000（处理血清）制备标曲溶液。E2的校准范围为3~1000 pg/mL（约11.1~3700 pmol/L），E1为2~1000 pg/mL（约7.4~3700 pmol/L）。使用购自Golden West Biologicals（美国加利福尼亚州特曼库拉）的替代基质MSG4000（处理人血清）制备QC样品，各QC样品的浓度约为10 pg/mL、75 pg/mL和750 pg/mL（约37 pmol/L、275 pmol/L和2750 pmol/L）。使用ELGA（High Wycombe，英国）的水净化系统在实验室内部制备蒸馏水。甲醇和乙酸乙酯购自Honeywell（英国布拉克内尔）。氟化铵和正己烷购自Sigma-Aldrich（英国吉林汉姆）。

注：将E2数据乘以3.671，E1数据乘以3.699即可将传统的质量单位(pg/mL)转换为SI单位(pmol/L)。

样品提取

将20 µL内标（[13C3]-E2和[13C3]-E1约2 ng/mL）加入250 µL样品中，混匀。加入1 mL 85:15 (v:v)正己烷:乙酸乙酯，充分混合10 min以进行液/液萃取。将样品以4000 g离心5 min，然后取700 µL上层有机溶剂转移到带有1 mL玻璃内衬管的96孔板中（部件号：186000855）。将样品挥干并复溶于20 µL甲醇和30 µL蒸馏水中。

结果与讨论

人血清样品中E2和E1的色谱图如图2所示。

图2. E2和E1浓度分别为47.5 pg/mL (174.2 pmol/L)和37.3 pg/mL (137.9 pmol/L)时的典型色谱图

在五天内萃取并测定五个重复样品以评估精密度。E2和E1浓度为10~750 pg/mL (37~2775 pmol/L)时，总精密度和重复性为≤4.8% CV（表3）。

表3. E2和E1的分析精密度汇总

在5天内提取并定量分析使用处理血清制备的5个含低浓度E2和E1的样品，以此评估分析灵敏度。LLOQ为精密度（重复性）≤ 20% CV且S:N(ptp)≥10:1时的最低可测定浓度，此外，在2000 pg/mL下未观察到明显残留。E2的LLOQ定为3 pg/mL (11 pmol/L)（表4和图3），E1的LLOQ为2 pg/mL (7.4 pmol/L)。

表4. E2和E1的分析灵敏度汇总

图3为空白样品以及含低浓度E2的样品的典型色谱图。尽管LLOQ没有达到1 pg/mL (3.7 pmol/L)，但是空白的经处理血清样品可以与处理血清中添加1 pg/mL (3.7 pmol/L) E2的样品区分开来。图3还显示了确保E1与E2实现色谱分离的重要性，由图可见，在E2的MRM通道中可以观察到E1的同位素。

图3. 空白的经处理血清样品以及含低浓度E2的处理血清样品的色谱图

对于E2，该方法在0.434~1117 pg/mL (1.59~4099 pmol/L)范围内呈线性相关，对于E1，该方法在0.647~1113 pg/mL (2.39~4118 pmol/L)范围内呈线性相关，该结果是通过将低浓度和高浓度混合样品以已知比例混合，得到上述浓度范围内10个样品之后测定而得。加标处理血清样品得到的所有校准线都是线性的，测定十个不同样品中E2和E1时的确定系数(r2) > 0.998。

本研究测定了典型的内源性干扰物（白蛋白、胆红素、胆固醇、脂肪乳剂、甘油三酯和尿酸），与对照品相比得到的测试样品回收率(%)都在±15%以内。使用来自六个供体的血清样品研究基质效应。单独定量内源性干扰物的峰面积，使用平均峰面积调整低浓度和高浓度萃取后加标样品的结果，以便与溶剂加标样品的结果进行比较。虽然通过峰面积可以观察到基质因子有所变化，但这些变化可通过内标进行补偿（表5）。

表5. E2和E1的基质因子汇总

分析并计算40个CDC E2 Phase 1样品和53个UK NEQAS E2样品的浓度，与赋值比较，以评估准确度。表6和图4中可以看到E2的相关性，所得结果与两种EQA方案具有良好的一致性。对浓度分别为31、188和365 pg/mL（114、690和1340 pmol/L）的BCR认证参比物质样品进行萃取并分析，每个浓度一式三份，E2的所有测量值都在赋值±4.9%范围内。

表6. E2和E1的精密度汇总
图4. CDC E2 Phase 1值或UK NEQAS MS实验室修正后的平均值与Waters UPLC-MS/MS方法所得结果的Deming回归分析图比较

结论

本文介绍了一种使用UPLC-MS/MS分析血清中E2和E1的临床研究方法，该方法具有良好的分析灵敏度。其样品用量仅为250 µL血清，可以区分空白的经处理血清样品与相同基质中加标1 pg/mL E2的样品，并且无需衍生化。

该分析在五天的分批测定中表现出良好的精密度，并且在整个测定范围内表现出良好的准确度和线性，观察到的基质效应极低，测定的内源性化合物未造成显著干扰。

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720006315ZH，2018年6月

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