使用UPLC-MS/MS方法定量人尿液中的EtG和EtS

本应用纪要重点介绍开发的一种快速、简便的“稀释-上样”方法，可使用UPLC-MS/MS明确鉴定并定量分析人尿液中的乙基葡萄糖醛酸苷(EtG)和硫酸乙酯(EtS)，适用于法医毒理学应用。

优势

采用简单的“稀释-上样”样品制备方法。

乙醇的消耗与世界各地巨大的社会经济负担密不可分¹。 因此，检测和鉴定乙醇摄入的需求日益增长。多年来，乙基葡萄糖醛酸苷(EtG)和硫酸乙酯(EtS)已成为检测近期内乙醇摄入的可靠生物标志物^2,3。 EtG和EtS是乙醇的II相代谢物，微溶于水，在摄入乙醇后最长80小时内可在尿液中检出^2,4。 许多分析检测都将EtG和EtS作为生物标志物用于明确确认乙醇的摄入。本文作者开发了一种快速、简便的“稀释-上样”方法，可使用UPLC-MS/MS明确鉴定并定量分析人尿液中的EtG和EtS。

材料

尿液样品

用于制备校准品和质控样品(QC)的人尿液样品采集自近期内（至少一周）未摄入乙醇的志愿者。使用样品之前，通过免疫分析确认样品呈EtG阴性。采集可靠的样品作为常规案例的一部分。所有样品均储存于-20˚C下，不添加防腐剂。

参比标准品

EtG（乙基-β-D-葡糖苷酸，1.0 mg/mL）和EtS（硫酸乙酯，1.0 mg/mL）以及氘代类似物EtG-D5（乙基-β-D-葡糖苷酸D5，1.0 mg/mL）和EtS-D5（硫酸乙酯-D5，1.0 mg/mL）的药物参比物质购自Cerilliant Corporation（美国德克萨斯州）。氘代类似物用作内标。使用甲醇制备含有非氘代参比物质混合物（EtG：0.1 mg/mL和EtS：0.05 mg/mL）或内标混合物（EtG-D5：0.1 mg/mL和EtS-D5：0.05 mg/mL）的储备液，并储存于-20 ˚C下。用蒸馏水将储备液稀释400倍，制得内标工作溶液。

样品制备

尿液样品首先在7200 rpm（约4227 x g）下离心3 min，使其澄清。离心后，取50 µL尿液试液，上样至96孔板中（沃特世96孔样品收集板，2 mL方孔）。试液中加入500 µL内标工作溶液。稀释后，将样品涡旋混合1 min。

使用阴性人尿液样品稀释非氘代EtG/EtS储备溶液，制得一系列校准品和质控(QC)样品（表3）。经过简单的样品制备后，在多反应监测(MRM)模式下运行分析，使用两个通道采集EtG和EtG-D5的数据，使用一个通道采集EtS和EtS-D5的数据（图1）。对于EtG，使用阈值校准品（EtG/EtS：500/250 ng/mL）测定目标定量离子/定性离子比率，然后将其用于监测QC和未知样品。可接受标准为目标离子比率+/- 20%。

基于分析物定量离子响应与相应氘代内标定量离子响应之间的比率，生成标准曲线。使用1/x加权绘制回归线。EtG（r²范围：0.991–0.999）和EtS（r²范围：0.997–0.999）的标准曲线在考察的分析范围内呈线性，EtG和EtS的线性范围分别为200 ng/mL~10,000 ng/mL以及100 ng/m- L~5,000 ng/mL（图2）。EtG和EtS的cut-off值分别设置为500 ng/mL和250 ng/mL。使用最低浓度非零校准品方法确定检测限(LOD)，得到EtG和EtS的LOD分别为200 ng/mL和100 ng/mL。

使用三种浓度的QC样品（EtG 200、625和8000 ng/mL，EtS 100、312.5和4000 ng/mL）评估该方法的精密度和正确度。基于11个分析批（每个样品重复测定三次或四次）的结果，得到EtG的分析精密度(%CV)为8.4%~19.6%，正确度为98.4%~103.6%。EtS的分析精密度为4.7%~18.2%，正确度为96.4%~110.8%。总体而言，该方法表现出良好的精密度和正确度，结果汇总于表4中。

通过分析以水为基质的样品和尿液基质对照样品来评估基质效应，具体方法为分析10个分别加标以1000 ng/mL和500 ng/mL的EtG和EtS的阴性尿样和水性流动相，然后使用如下公式计算基质效应（结果以百分比表示）：[(A/B - 1) × 100%]，其中，A表示尿液基质中的离子响应，B表示不存在尿液基质时的离子响应。EtG和EtS的离子效应分别在1%~-58%和-54%~94.6%的范围内变化。基于“稀释-上样”进样方法，离子抑制效应预计在20%以上，不过，考虑到这一点，我们使用了与分析物匹配的氘代内标来补偿基质效应。使用该方法将数据归一化之后，获得了稳定的分析结果，符合精密度和正确度标准。初始样本和制备后的样品分别在-10 ℃和4 ℃下储存5天后，评估样品中EtG和EtS的稳定性。初始样本(n=6)、校准品和QC样品的重复分析结果偏差均不超过初始分析结果的20%。 

使用消除了识别信息的案例样本(n=34)，根据推定和确认的EtG和/或EtS阳性结果进行方法相关性研究。使用定性Microgenics DRI® EtG酶免疫分析法（cut-off值500 ng/mL）得到初始推定结果，由MedTox Laboratories, Inc.（美国明尼苏达州）使用经过验证的确认LC-MS/MS方法（参比方法）得到EtG和EtS的定量结果。完成初始分析后，将样本置于-10 ℃下储存六个月。表5列出了参比方法和开发的方法获得的结果。这两种方法得到的浓度分析结果的数据分散程度与预期的实验室间分散程度一致（图3）。不过，基于斜率和y截距的95%置信限的线性回归统计分析并未显示方法偏差（表6）。

许多分析检测都将乙醇代谢物作为生物标志物用于明确确认乙醇的摄入。本研究开发的方法具有出色的正确度和精密度，且具有通过尿样分析可靠地鉴定乙醇摄入所需的分析灵敏度。该方法的样品制备过程简单、色谱运行时间短，能够在高通量应用中显著提高EtG和EtS鉴定及定量分析的效率。 

致谢

感谢Michelle Wood（沃特世公司，英国威姆斯洛）、Robert Lee（沃特世公司，英国威姆斯洛）、Jonathan Danaceau（沃特世公司，美国马萨诸塞州米尔福德）和Scott Freeto（沃特世公司，美国马萨诸塞州比佛利）在本方法开发过程中提供的技术支持和建议。

1. World Health Organization (WHO). Global Status Report on Alcohol and Health.p. XIV.2014 ed.
2.  Jaakonmaki PI, Knox KL, Horning EC, Horning MG.Eur.J. Pharmacol. (1967) 1:60–70.
3. Rosano TG, Lin JJ.Analytical Toxicology. (2008) 32:594-600.
4. Wurst FM, Skipper GE, Weinmann W. Addiction.(2003) 98 (Suppl 2): 51–61.