• 应用纪要

LipidQuan：使用基于HILIC的LC-MS/MS系统对磷脂（PE、LPE、PG和PI）进行高通量靶向筛查

LipidQuan：使用基于HILIC的LC-MS/MS系统对磷脂（PE、LPE、PG和PI）进行高通量靶向筛查
  • Nyasha Munjoma
  • Giorgis Isaac
  • Lee A. Gethings
  • Robert S. Plumb
  • Waters Corporation
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仅供研究使用，不适用于诊断。

摘要

本应用纪要介绍了在LipidQuan平台上运行基于HILIC的方法对血浆中的溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油和磷脂酰肌醇进行的靶向筛查。

本研究开发了一种使用基于HILIC的色谱分离和MRM MS检测快速、特异性地分析人血浆中LPE、PE、PG和PI的LC-MS/MS方法。在负离子模式下分析PE、PG和PI，在正离子模式下分析LPE。HILIC方法有利于分类洗脱脂质，PG最先洗脱(~1.21 min)，然后是PE (~1.62 min)、LPE (~2.34 min)、PI (~2.40 min)。利用该方法在八分钟内定量鉴定了11种LPE、47种PE、21种PG和33种PI，线性动态范围覆盖4个数量级。得益于该方法的灵敏度，使用一份50 µL的血浆可轻松检测出人血浆中正常循环水平的这些脂质。

优势

  • 快速定量血浆中的112种磷脂（47种PE、11种LPE、21种PG、33种PI）
  • 使用两个脂肪酰基链碎片的MRM通道改善磷脂（PE、PG、PI）的鉴定和鉴别
  • 使用Quanpedia和SOP构建性能稳定、便于部署的平台，降低方法开发和培训成本
  • 使用TargetLynx软件和第三方信息学软件（即Skyline）实现快速数据处理和数据可视化

简介

甘油磷脂(GPL)通常含有两条脂肪酰基链和一个结合在甘油骨架上的磷酸酯化头部基团（图1），头部基团定义该GPL。溶血磷脂是磷脂去掉一条或两条脂肪酰基链后得到的衍生物。

图1.PE、PG、PI的结构展示。甘油骨架的3号位(sn-3)与磷酸残基结合发生酯化，R1和R2代表sn-1和sn-2位不同的脂肪酸链。

在生物学上，GPL是所有生物膜的重要组成部分，其具有选择渗透性，可发挥保护屏障作用从而促进细胞代谢。近年来，由于人们了解到这类脂质与大量疾病有关，因此对其展开了越来越多的测量研究。磷脂酰乙醇胺(PE)是丰度第二高的甘油磷脂（丰度最高的是磷脂酰胆碱），占哺乳动物细胞内总GLP的15-25%1。 PE代谢紊乱与慢性病（阿尔茨海默病和帕金森病）和传染病（念珠菌病）都有一定关联1。 真核生物线粒体膜中只观察到一小部分磷脂酰甘油(PG)2。 但PG是心磷脂的生物合成前体，心磷脂是线粒体膜的主要成分，在维持这些生物膜的电位方面至关重要。磷脂酰肌醇(PI)在生物膜结构方面的作用不大，但在生物膜结合的信号传导过程和囊泡活动中起主要作用2。

虽然质谱(MS)技术的进步让研究人员得以进行更深入的脂质组学分析，但由于脂质有大量的同分异构和同量异位物质，精准鉴定和定量分析依然比较困难。MS谱图中通常含有不同化合物的多个峰和碎片，要想对特定的分子进行可靠鉴定和相对定量，难度极大。因此，在多中心研究中生成的脂质组学数据可能无法相互传递，导致数据的生物学解释不可信。 

使用基于亲水作用色谱(HILIC)的方法分离不同类别的脂质，然后使用MS进行检测，此方法经证明能够降低鉴定结果的不确定性3。 按照类别分离不同的脂质还可以减少定量分析所需的稳定同位素标记(SIL)标准品，进而降低成本。本应用纪要介绍了在LipidQuan平台（图2）上运行基于HILIC的方法对LPE、PE、PG和PI进行的靶向筛查。

图2. 大多数研究实验室的通用脂质组学工作流程，图中突出显示了LipidQuan工作流程。

实验

样品

向混合的健康人血浆中添加稳定同位素标记(SIL)标准品（SPLASH LIPIDOMIX，Avanti Lipids，美国亚拉巴马州阿拉巴斯特），制备九个不同浓度的标准品用于绘制定量用的标准曲线（LPE (18:1) (d7) = 0.5–250 ng/mL、PE (15:0–18:1) (d7) = 0.5–250 ng/mL、PG(15:0–18:1) (d7) =3.0–1500 ng/mL、PI (15:0–18:1) (d7) = 1.0–500 ng/mL）。

另外，通过萃取前加标的方式向NIST标准参比物质1950血浆中（Sigma Aldrich，英国普尔）添加5% SIL，制备6个重复样。

样品制备

样品制备方案很简单，使用预冷的异丙醇(IPA)沉淀蛋白（1:5，血浆:IPA）即可。将样品涡旋混合1 min，在-20 °C下放置10 min。接着再将样品涡旋混合1 min，然后在4 °C下放置2 h，确保蛋白沉淀完全。将萃取的样品在4 °C下离心10 min（最大离心力10,300 g），然后将上清液转移至玻璃样品瓶，进行LC-MS/MS分析。

LC条件

LC系统：

ACQUITY UPLC I-Class系统固定定量环(FL)或流通针式(FTN)

色谱柱：

ACQUITY UPLC BEH Amide 2.1 × 100 mm, 1.7 µm

柱温：

45 °C

流速：

0.6 mL/min

流动相A：

95:5乙腈/水+ 10 mM醋酸铵

流动相B：

50:50乙腈/水+ 10 mM醋酸铵

梯度：

流动相B在2 min内从0.1%升至20.0%，然后在3 min内从20%升至80%，随后重新平衡3 min

运行时间：

8 min

进样体积：

2 µL（负离子模式）

1 µL（正离子模式）

MS条件

MS系统：

Xevo TQ-XS、TQ-S、Xevo TQ-S micro

电离模式：

ESI (+/-)

毛细管电压：

2.8 kV (+)/1.9 kV (-)

采集模式：

MRM

离子源温度：

120 °C

脱溶剂气温度：

500 °C

锥孔气流速：

150 L/h

脱溶剂气流速：

1000 L/h

雾化气：

7 bar

离子导入装置偏移1：

3 V

离子导入装置偏移2：

0.3 V

信息学软件

LipidQuan Quanpedia方法文件（1.4版），包含LC条件、MS方法以及相关的TargetLynx软件处理方法（包括保留时间）。使用TargetLynx或Skyline（华盛顿大学MacCoss实验室软件）处理所得数据。

结果与讨论

本研究开发了一种使用基于HILIC的色谱分离和MRM MS检测快速、特异性地分析人血浆中LPE、PE、PG和PI的LC-MS/MS方法。在负离子模式下分析PE、PG和PI，在正离子模式下分析LPE。HILIC方法有利于分类洗脱脂质，PG最先洗脱(~1.21 min)，然后是PE (~1.62 min)、LPE (~2.34 min)、PI (~2.40 min)（图3和图4）。利用该方法在八分钟内定量鉴定了11种LPE、47种PE、21种PG和33种PI，线性动态范围覆盖4个数量级。得益于该方法的灵敏度，使用一份50 µL的血浆可轻松检测出人血浆中正常循环水平的这些脂质。 

图3.在负离子模式下使用HILIC从SPLASH LIPIDOMIX标准品混合物中分离PG、PE、PI得到的色谱图(A)。LPE在正离子模式下测量(B)。
图4. 显示内源性LPE和相应SIL分类分离的HILIC色谱图，可定量分析。 

由于事先已开发好LipidQuan Quanpedia方法文件，用户只需下载和导入用于分析LPE、PE、PG和PI的MRM通道和色谱条件即可，无需手动输入LC-MS/MS方法，因此避免了可能出现的抄录错误。

LipidQuan Quanpedia方法文件采用高特异性MRM通道检测219种PG、279种PE和90种PI中含有的脂肪酰基链碎片，增强了方法特异性，从而改善了脂质鉴定结果。虽然LPE和PE的头部基团相同，但该方法可以根据不同类别对这些脂质进行色谱分离，从而减少潜在的同分异构和同量异位干扰（图3）。由于LPE和PE前体的质量范围分别为398–476 Da和686–851 Da，没有重叠，因此可以进一步减少同量异位效应。 

使用萃取前加标已知浓度SIL标准品的血浆样品制备标准曲线用于定量分析。上述SIL用作替代标准品定量分析同一类内源性脂质。每一类内源性脂质使用一种替代标准品，而不是每种待测内源性脂质使用一种SIL标准品，可以显著降低大规模研究的成本。PI (15:0/18:1) (d7)和PG (15:0/18:1) (d7) SIL标准品的标准曲线示例如图5A/5B所示，可用于定量内源性PI和PG。负离子模式下PE (15:0/18:1) (d7)和正离子模式下LPE (18:1) (d7)的标准曲线示例如图5C/5D所示。 

图5.典型血浆筛查分析中负离子模式下的PI (15:0/18:1) (d7) (1–500 ng/mL) (A)、PG (15:0/18:1) (d7) (3–1500 ng/mL) (B)、PE (15:0/18:1) (d7) (0.5–250 ng/mL) (C)标准曲线。典型血浆筛查分析中正离子模式下的LPE (18:1) (d7) (0.5–250 ng/mL) (D)标准曲线。通常情况下的指定接受标准为：R2值>0.95，最佳拟合直线的偏差(CV) < 30%。

本研究使用编写的LipidQuan Quanpedia方法文件（LipidQuan Quanpedia文件1.4版）采集数据，如下所示。在常规分析中实现了典型R2值等于0.95，最佳拟合直线的偏差(CV) < 30%（表1-5）。

表1.加标SIL的反算浓度以及NIST血浆中SIL的实际加标浓度如下（单位ng/mL）。
表2.NIST标准参比物质® 1950血浆中内源性LPE脂质的MRM通道，CV <30%。LPE (18:1) (d7)的校准范围为0.5–250 ng/mL。
表3.NIST标准参比物质® 1950血浆中内源性PE脂质的MRM通道，CV <30%。PE (15:0–18:1) (d7)的校准范围为0.5–250 ng/mL。
表4.NIST标准参比物质® 1950血浆中内源性PI脂质的MRM通道，CV <30%。PI (15:0–18:1) (d7)的校准范围为1-500 ng/mL。
表5.NIST标准参比物质® 1950血浆中内源性PG脂质的MRM通道，CV <30%。PG (15:0–18:1) (d7)的校准范围为3-1500 ng/mL。

结论

  • 本研究开发了一种快速分析血浆中LPE、PE、PG和PI脂质的定量方法。
  • 该方法可在八分钟内分析11种LPE、47种PE、21种PG和33种PI。
  • 该方法在四个数量级内呈线性，并且具有足够的灵敏度，可分析人血浆中的内源性脂质。
  • 使用HILIC进行色谱分离，不同脂质根据其类别洗脱，减少了潜在的同分异构/同量异位物质干扰，也减少了定量分析所需的稳定同位素标记标准品，分析成本得以降低。

参考文献

  1. Calzada, E., Onguka, O., Claypool, S. M. (2016). Phosphatidylethanolamine Metabolism in Health and Disease. International Review of Cell and Molecular Biology, 321, 29–88. http://doi.org/10.1016/bs.ircmb.2015.10.001.
  2. Tracey, T. J., Steyn, F. J., Wolvetang, E. J., Ngo, S. T. (2018).Neuronal Lipid Metabolism: Multiple Pathways Driving Functional Outcomes in Health and Disease. Frontiers in Molecular Neuroscience, 11(January), 1–25.http://doi.org/10.3389/fnmol.2018.00010.
  3. Cifkova, E., Holcapek, M., Lisa, M., Ovcacikova, M., Lycka, A., Lynen, F., Sandra, P. (2012). Nontargeted Quantitation of Lipid Classes Using Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography-Electrospray Ionization Mass Spectrometry with Single Internal Standard and Response Factor Approach. Analytical Chemistry, 84(22), 10064–10070. http://doi.org/10.1021/ac3024476.

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