在生物医学研究中使用Kairos氨基酸试剂盒对45种氨基酸进行UPLC-MS/MS分析

本研究将介绍使用Kairos氨基酸试剂盒对溶液中的45种氨基酸进行分析。使用配备CORTECS UPLC C₁₈色谱柱的ACQUITY UPLC I-Class系统进行色谱分离，然后在Xevo TQ-S micro系统上进行检测。

Kairos氨基酸试剂盒使生物医学研究人员能够通过一套灵活的试剂盒获得值得信赖的结果，利用这套试剂盒，他们能够在10分钟内使用ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQ-S micro联用系统对处于正常生理浓度范围内的42种氨基酸进行准确定量。

优势

• 色谱方法具有出色的分析选择性，可以分离同分异构体
• 分析运行时间短(<10 min)
• 峰检测的可信度高
• 灵活性更高，系统可用于其它分析

Kairos氨基酸试剂盒（仅供研究使用）设计使生物医学研究人员能够在10分钟内完成对多达45种生物相关氨基酸的分析。已在适用情况下使用更高级参比物质为试剂盒校准品进行赋值，从而提高分析结果的可信度。Kairos氨基酸试剂盒校准品中9种氨基酸的量值可溯源至日本国家计量院（NMIJ CRM 6011a-6018a，6022a），另外8种可溯源至美国国家标准技术研究所(NIST SRM 2389a)，其余氨基酸使用购自Sigma-Aldrich的TraceCERT标准品（如果适用）通过重量法制得。

本文将介绍使用Kairos氨基酸试剂盒对溶液中的45种氨基酸进行分析。使用配备CORTECS UPLC C₁₈色谱柱的ACQUITY UPLC I-Class系统进行色谱分离，然后在Xevo TQ-S micro系统上进行检测（图1）。利用样品溶液对试剂盒和分析系统的性能进行评估；另外，出于生物医学研究目的，对NIST SRM 2389a 物质和基质样品（尿液和血浆）进行分析。

所用的色谱条件可以分离亮氨酸、甲基组氨酸、丙氨酸和氨基丁酸同分异构体。

试剂盒

Kairos氨基酸试剂盒（部件号：176004379）

试剂盒复溶

复溶冻干的Kairos氨基酸试剂盒时，请按照维护和使用手册（部件号：720005448EN）进行操作。用2 mL 0.1 M HCl复溶校准品和QC样品，在室温下混合至少30 min，确保所有物质完全溶解。

用2 mL水复溶内标，在室温下混合10 min，确保所有物质完全溶解。将样品瓶内容物转移至容量瓶中，使用试剂盒中提供的10%磺基水杨酸将其定容至10 mL。

试剂制备

制备Kairos氨基酸试剂盒试剂、硼酸盐缓冲液和AccQ•TagUltra“3X”衍生化试剂盒试剂时，请按照维护和使用手册进行操作。

硼酸盐缓冲液制备：将430 μL 0.5 M NaOH水溶液加入衍生化试剂盒中提供的6 mL硼酸盐缓冲液中（试剂1）。有效期：3个月。储存条件：室温。

AccQ•Tag Ultra“3X”试剂：用1.5 mL乙腈（试剂2A）复溶AccQ•Tag Ultra“3X”（试剂2B）。在55 °C下加热10 min并涡旋混合。有效期：5天。储存条件：室温。AccQ•Tag Ultra复溶后，应储存在干燥器内。

样品制备

第1步向1.5 mL Eppendorf管中加入50 µL样品

第2步加入50 µL 50 µM的内标

第3步涡旋混合5 s

第4步加入50 µL水

第5步涡旋混合5 s

第6步仅适用于高浓度样品– 加入1000 µL稀释剂(0.1 M HCl)

第7步在9000 g下离心15 min

第8步向最大回收样品瓶中加入70 µL硼酸盐缓冲液

第9步向硼酸盐缓冲液中加入10 µL上清液并移取混合液

第10步加入20 µL AccQ•Tag Ultra“3X”试剂

第11步涡旋混合5 s

第12步在室温下静置样品1 min

第13步在55下加热10 min

第14步进样2 µL

在精密度和准确度研究中，用0.1 M HCl通过重量法为所有氨基酸制得浓度为20、150、400和700 µM的样品组合，并另外为丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺制得浓度为2500 µM的高浓度样品组合。

分析高浓度样品之后，在后续的所有氨基酸空白进样中未观察到明显的系统残留污染（校准品1的检测器响应≤20%）。 

在三天内连续配制样品组合并重复分析五次(n=15)来测定精密度，计算每组样品的日内和日间精密度(%CV)。每组样品的日内精密度≤6.9% CV，日间精密度≤16.3% CV（不含精氨基琥珀酸时≤13.9% CV），平均日内和日间精密度≤13.9% CV，如表2所示。

为评估线性，在三天内每天对Kairos氨基酸试剂盒校准品进行分析。回归分析的结果表明，对于所分析的45种氨基酸，在考察的浓度范围内使用1/x加权均实现了线性拟合（表3）。各氨基酸的确定系数(r²)均大于0.99，其中校准品的反算浓度处于标示值±15%的范围内（在LLOQ的浓度下除外，其反算浓度处于标示值±20%的范围内）。至少75%的校准品满足这一标准，三种以红色突出显示的分析物（羟脯氨酸、胱硫醚、精氨基琥珀酸）除外。

在一天内对用0.1 M HCl制得的浓度范围为1–20 µM的样品重复分析五次进行灵敏度评估。在分析物峰的信噪比≥10:1且重复分析的精密度≤20% CV的情况下，测定每种分析物的LLOQ。除S-硫基胱氨酸、精氨基琥珀酸(20 µM)和肌肽(15 µM)外，分析的所有45种氨基酸的LOQ均≤5 µM，如表4所示。

通过分析单独制备的样品以及NIST SRM 2389a（开始分析前，采用重量法将浓度稀释至400 µM）进行准确度评估。在检测的浓度范围内，所有样品的浓度偏差均≤ ±20.4%（范围为-18.5～+20.4%），三种以红色突出显示的分析物（羟脯氨酸、胱硫醚、精氨基琥珀酸）除外。对于参比物质中存在的分析物，NIST SRM 2389a稀释后浓度计算值的浓度偏差≤ ±10.0%（范围为-10.0～+3.7%），所有数据均汇总于表5中。

对尿液和血浆样品进行分析，证明该方法能够分析生理浓度下的氨基酸。图2所示为血浆样品中11种氨基酸的总离子流色谱图(TIC)和一张色谱图插图，该插图突出显示了同一血浆样品中γ-氨基丁酸、β-氨基异丁酸和α-氨基丁酸的色谱分离结果。

Kairos氨基酸试剂盒使生物医学研究人员能够通过一套灵活的试剂盒获得值得信赖的结果，利用这套试剂盒，他们能够在10分钟内使用ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQ-S micro联用系统对处于正常生理浓度范围内的42种氨基酸进行准确定量。 

采用AccQ•Tag Ultra“3X”衍生化试剂盒对样品进行衍生化，可通过简单、稳定且快速的反相UPLC方法分析氨基酸，无需使用流动相缓冲液或离子对试剂。这意味着无需专用系统，因此ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQ-S micro联用系统还可以用于其它分析。衍生化样品具有良好的稳定性，并且在所用的色谱条件下，研究人员在10分钟内即可分离氨基酸异构体，并提供可靠的峰鉴定结果。

Kairos氨基酸试剂盒（仅供研究使用）中所述的方法使研究人员能够使用ACQUITY UPLC I-Class/Xevo TQ-S micro联用系统对溶液中的42种氨基酸进行定量分析，并获得良好的精密度、线性、灵敏度和准确度。该试剂盒中的其余三种分析物（羟脯氨酸、胱硫醚和精氨基琥珀酸）仅适用于半定量分析。