使用Andrew+自动化制备方法进行氨基酸分析

本应用纪要的目的是证明手动制备AccQ•Tag标记的氨基酸与使用Andrew+液体处理设备以氨基酸标准品试剂盒进行制备的方法相比，二者之间的等效性与稳定性。

氨基酸是构成蛋白质的最基本成分，因此在细胞培养基和食品中必不可少。要确保为细胞提供最佳生长条件，必须即时监测并优化生物反应器培养基的氨基酸成分。此外，还需要确认食品符合规定的要求。因此，氨基酸分析是一项重要而常规的分析。

样品制备和分析过程非常耗时，可能占用分析人员在实验室中的大部分时间。自动化实验室制备系统使分析人员能够灵活安排时间处理其他任务，实现更有效的时间管理。沃特世推出了针对Andrew Alliance Andrew+平台的自动化样品制备方案，该方案与AccQ•Tag Ultra衍生化自动化试剂盒（部件号：186009232）（图1）和氨基酸标准品试剂盒结合使用。由于自动化系统对死体积的要求更高，AccQ•Tag Ultra衍生化自动化试剂盒增加了试剂量，以便用于自动化系统。随附的试剂量可用于制备多达96个样品，采用3×32个样品的形式。

沃特世可提供包含21种氨基酸的食品和饲料试剂盒以及包含26种氨基酸的氨基酸细胞培养标准品试剂盒（表1）。Andrew+液体处理设备的方案存储在OneLab，这是一款云端软件，具有直观的图形界面，非常方便用户操作。本应用纪要使用细胞培养氨基酸标准品以及食品和饲料氨基酸标准品展示了手动和自动样品制备方法获得的结果。

工作流程为：先进行手动或自动样品制备，然后进行液相色谱分析并利用Empower软件处理数据。

设计因子

方案特点

基于AccQ•Tag衍生化自动化试剂盒，针对Andrew+液体处理设备创建了一组样品制备方案，包含用于32、64和96个样品的三种方案。此外，OneLab中提供了标准曲线和试剂制备方案，这是一款针对互联设备进行方案设计和执行的软件。标准曲线方案能够在500 µM～0.5 µM（胱氨酸250 µM～0.25 µM）的参比范围内执行标准品稀释。然后使用稀释所得的标准品结合样品制备方案，绘制7点标准曲线。

试剂制备方案可与Pipette+互联电子移液器结合使用，制备用于样品制备和衍生化方案的试剂和标准品。制备样品时，还可以灵活加入正缬氨酸内标（部件号：186009301）。

实验器皿

以AccQ•Tag衍生化试剂盒手动制备氨基酸样品使用的是沃特世全回收样品瓶。为兼容该自动化方案，将全回收透明玻璃样品瓶替换为96孔Lo Bind PCR板（部件号：0030129555）。此实验器皿还适合在制备过程中与Shaker+、Peltier+和夹钳配合使用。针对实验器皿更改执行测试以证明更改可行，结果表明更改实验器皿对产品性能无影响。

实验设计

使用手动方法和Andrew+样品制备方法制备食品和饲料以及细胞培养标准品。使用AccQ•Tag Ultra衍生化自动化试剂盒以及至少两个不同批次的色谱柱和AccQ•Tag Ultra流动相洗脱液。对于食品和饲料以及细胞培养物，均创建了涵盖浓度范围（10 µM、200 µM和400 µM）的三个溶剂组(0.1 M HCl)。这些溶剂组包含相关氨基酸以评估制备性能。

本研究评估了使用Andrew+平台的自动化制备方法，并将该方法与手动制备方法进行比较，以研究稳定性和等效性。在三种浓度水平（10 µM、200 µM和400 µM）下监测性能特征，确定结果的准确度和精密度（保留时间、分析物峰面积和浓度）以及线性。使用AccQ•Tag Ultra 32样品方案，每个浓度制备六份样品，总共评估18种样品。制备一份溶剂组，重复进样两次。计算第一次进样的结果。仅在仪器出现问题时才分析重复进样的结果作为备份。所有实验均使用正缬氨酸作为内标。使用正缬氨酸作为内标可以有效补偿样品水解和氨基酸分析产生的差异性。

精密度

为证明自动化样品制备方法与手动制备方法的重现性，确定了每个浓度水平下的%CV。对于细胞培养物，Andrew+和手动制备方法的所有氨基酸在所有浓度水平下的平均%CV上限分别为2.0%和2.3%。对于食品和饲料，Andrew+和手动制备方法的所有氨基酸在所有浓度水平下的平均%CV上限分别为1.7%和2.8%。表3和表4的数据表明，Andrew+与手动制备方法的精密度相当。

准确度

在10 µM、200 µM和400 µM浓度下评估准确度，每种浓度制备六份样品。利用六份样品的平均浓度计算与目标值之差，确定回收率%。细胞培养物以及食品和饲料中各氨基酸的回收率%均在目标浓度的10%以内（表5和表6）。这些回收率数据表明，Andrew+非常适合作为氨基酸手动衍生化方法的替代选择，有助于节省时间。

线性

使用细胞培养标准品为每种氨基酸制备七个浓度水平，浓度范围0.5 µM～500 µM（胱氨酸0.25 µM～250 µM），用于评估线性。对所有分析的线性进行评估，结果均符合r²>0.995的标准，且校准品2-7 (2.5 µM～500 µM)的浓度点与预期浓度的偏差不超过15%，校准品1 (0.5 µM)的偏差不超过20%。利用手动制备方法和自动制备方法获得的数据一致，未观察到任何趋势。

利用精密度、准确度和线性等性能特征确定Andrew+制备方法与手动制备方法的等效性。结果表明，两种样品制备方法在UPLC氨基酸分析解决方案中表现出优异的可比性，但在进行对比分析时，自动化方法在便捷方面的优势也不容忽视：

• Andrew+机器人可以在1 h内完成校准标样制备和样品制备，在不影响准确性和精密度的情况下提高效率。
• 开发的自动化方案在运行过程中无需手动干预，得益于配置蓝牙功能的移液器实现不同体积切换，以及夹钳设备轻松转移实验器皿，使分析人员有时间执行其他实验室任务。
• OneLab云端软件允许用户利用任何可用的联网计算机或平板电脑监测运行状况。
• 运用自动化方法可以消除分析人员之间的差异性，使实验室和公司能够实现分析方法标准化，并促进方法在多个研究地点之间转移。
  

致谢

Danielle Cullen，Niamh Stafford，Leanne Davey，Norma Breen（沃特世科技爱尔兰有限公司）；Steven Calciano，Ning Zhang（沃特世公司，美国马萨诸塞州米尔福德）。