使用Andrew+移液机器人自动化完成中高通量的GlycoWorks RapiFluor-MS样品前处理

使用Andrew Alliance提供的Andrew+移液机器人，实现GlycoWorks RapiFluor-MS N-糖标记24和48样品试剂盒的自动化并验证性能。验证要求包括：与同数量样品的手动前处理结果相比，总峰面积偏差≤25%，相对峰面积偏差≤5%。此外，前处理批次内的相对标准差也必须满足上述要求。结果表明，24样品自动化方案与手动前处理方案相比，总峰面积偏差为12.3%，相对峰面积偏差为0.0%。48样品自动化方案的结果也与24样品手动前处理方案相当，总峰面积偏差为23.0%，相对峰面积偏差为0.0%。48样品自动化方案还表现出优异的前处理批次内重现性，2次前处理得到的总峰面积相对标准差分别为11.6%和15.2%。

优势

• 中等通量N-糖分析
• 高通量N-糖分析
• 经济有效的机器人解决方案
• 协同自动化
• 快速N-糖标记
• 自动方法转移
• 为终端用户节省时间
• 提高效率

在生物药开发过程中，通常将糖基化作为一项关键质量属性(CQA)进行监测，因为它是衡量生产条件一致性、产品疗效和安全性的指标^1,2。 传统的游离N-糖标记方法可能需要数小时甚至数天才能完成，并且标记通常不稳定。此外，传统标记无法同时提供优异的荧光和质谱检测灵敏度，导致研究实验室只能限定使用其中一种检测方法。

有明确记载的事实显示，沃特世推出的GlycoWorks RapiFluor-MS N-糖标记试剂盒及相关方案能够缩短准确标记所需的时间，同时提高荧光和质谱检测能力³。 该标记工作流程以及HILIC净化和样品采集工作可在一小时内完成（具体取决于样品数量），且该方法操作简单，实现自动化相对容易⁴。 该程序实现自动化的主要优势在于，能够缩短分析人员进行样品前处理所需的时间，减少培训和文档记录负担，以及降低因单调乏味的移液操作引发错误的可能性。考虑到这一点，2018年，沃特世利用Andrew Alliance移液机器人(Andrew)让GlycoWorks RapiFluor-MS试剂盒实现了自动化⁵。

该自动化方案经过多轮优化，可确保单克隆抗体(mAb) N-糖的完全释放和标记与手动执行方案时获得的结果相当。同一样品的用户手动制备方案与自动方案相比，小鼠单克隆抗体标准品中释放的主要糖型和次要糖型的相对标准差为9-19%。

2019年，Andrew Alliance发布新版移液机器人，名为Andrew+（图1）。该系统采用网络连接装置以及可同时兼容单通道和多通道电子移液的改良机械臂，大幅节省时间并提高样品处理通量。本应用简报提供的数据表明，该自动化平台适用于处理中等通量（24个样品）和高通量（48个样品）的GlycoWorks RapiFluor-MS游离N-糖分析。

之前的应用简报中详细介绍了在Andrew+系统上优化低通量（8个样品）GlycoWorks RapiFluor-MS方案的过程⁶。 由于执行中高通量的样品前处理方案需要额外的时间，因此方案的洗脱和后期样品稀释步骤所用的重要试剂不会立即添加到自动化工作台上。这样做的目的在于防止试剂蒸发并防止因体积减小而导致本可避免的移液错误。在开发和测试这些自动化方案的过程中，使用快速分析方法加快开发速度。为简化处理流程，只监测小鼠单克隆抗体的4个主峰。图2显示了中等通量（24个样品）自动化方案的验证结果。

与经验丰富的用户手动前处理方案相比，利用自动化24样品前处理方案得到的结果偏差在方案验证设定的偏差限值25%范围内，使用自动化平台得到标记游离寡糖的回收率高达87.7%（表1）。此外，相对峰面积比较显示与手动样品前处理的偏差为0%。总体而言，中等通量GlycoWorks RapiFluor-MS自动化解决方案的结果与手动解决方案相当。

图2还显示了高通量（48个样品）自动化方案的验证结果。原本尝试比较自动化48样品前处理方案与手动48样品前处理方案，但经过多次尝试，经验丰富的用户也无法手动有效处理如此之多的样品。而这正好凸显了利用Andrew+机器人实现高通量程序自动化的优势。计算两次前处理结果的平均值，机器人处理得到的标记N-糖回收率与中等通量方法处理得到的回收率（图2）相当，与手动处理中等通量样品相比，总峰面积偏差为23%，相对峰面积偏差为0%（表1）。

总体而言，使用自动化前处理方案时，总峰面积的相对标准差略高于由经验丰富的用户手动进行前处理得到的结果（表2）。自动化24样品前处理方案显示的相对标准差不超过11.3%，自动化48样品前处理方案显示的相对标准差不超过15.6%。对于相对峰面积，所有前处理方案（自动和手动）的平均相对标准差均约0.5%，再次证明GlycoWorks RapiFluor-MS方案在保持准确标记方面的稳定性。

使用Andrew+液体处理平台开发自动化中等通量（24个样品）和高通量（48个样品）GlycoWorks RapiFluor-MS方案。上述自动化解决方案使GlycoWorks产品脚本更加完善，这些脚本能够运用于运行Andrew+系统所需的OneLab软件中，并可以立即下载。两种脚本与手动执行的方案均表现出优异的可比性，满足相应的偏差要求，即，与手动前处理的样品相比，总峰面积的偏差≤25%，相对峰面积的偏差≤5%。

1. Fournier, J. A Review of Glycan Analysis Requirements.2015.
2. Dahodwala, H.; Sharfstein, S. T. Biosimilars: Imitation Games; ACS Publications, 2017.
3. Lauber, M. A.; Yu, Y.-Q.; Brousmiche, D. W.; Hua, Z.; Koza, S. M.; Magnelli, P.; Guthrie, E.; Taron, C. H.; Fountain, K. J. Rapid Preparation of Released N-Glycans for HILIC Analysis Using a Labeling Reagent That Facilitates Sensitive Fluorescence and ESI-MS Detection.Anal.Chem. 2015, 87 (10), 5401–5409.
4. Koza, S. M.; McCall, S. A.; Lauber, M. A.; Chambers, E. E. Quality Control and Automation Friendly GlycoWorks RapiFluor-MS N-Glycan Sample Preparation (720005506EN).Waters Corporation May 2020. 
5. Reed, C. E.; Fournier, J.; Vamvoukas, N.; Koza, S. M. Automated Preparation of MS-Sensitive Fluorescently Labeled N-Glycans with a Commercial Pipetting Robot.SLAS Technol.Transl.Life Sci.Innov. 2018, 23 (6), 550-559.
6. Reed, C. E.; Koza, S. M.; Calciano, S. GlycoWorks RapiFluor-MS Automation Using the Andrew+ Pipetting Robot (720006971EN).Waters Corporation August 2020.