使用Xevo G2-XS QTof上的Tof MRM开发定量分析N-亚硝胺的高灵敏度、高分辨率质谱方法

N-亚硝胺具有潜在的致癌性，并普遍存在于各类人用商品和药品中，因此，对各种基质中的N-亚硝胺进行监测受到极大关注。这些杂质需要在亚ng/mL范围内进行高灵敏度、高选择性检测。以下方法使用高灵敏度、高选择性QTof采集模式，能够同时检测和定量六种得到广泛分析的N-亚硝胺（NDMA、NDEA、NMBA、NDBA、NEIPA和NDIPA），其含量等于或小于0.1 ng/mL。该采集模式称为Tof MRM，通过在四极杆中分离分析物母离子m/z，然后靶向增强信号，从而提高选择性。本文介绍了使用Tof MRM方法分析六种N-亚硝胺得到的UPLC色谱分离结果以及LLOD、LLOQ和线性。报告了该方法对NDMA和NDEA的定量性能，证明在1.25 ng/mL和12.5 ng/mL质量控制(QC)水平下可实现精密、准确且可重复的测量。此外，使用UNIFI科学信息系统进行数据采集和处理，提供了一套现代化平台用于对研究的N-亚硝胺进行符合GxP要求的HRMS分析。

N-亚硝胺属于小分子化合物，通常为硝酸盐和胺之间形成的反应产物¹。 这些化合物是已知的潜在致癌物²，因此需要主动监测以减少人体暴露。 这类物质存在于天然水系统²、烟草制品中²，并以杂质形式存在于药品中^1,3,4。 2019年，在非处方药雷尼替丁中检出N-亚硝基二甲胺(NDMA)引起人们特别关注，该药物是一种组胺2受体阻滞剂，可用于治疗胃食管反流疾病和胃/肠溃疡⁵。 此外，还发现NDMA、N-亚硝基二乙胺(NDEA)和N-亚硝基-N-甲基-4-氨基丁酸(NMBA)以杂质形式存在于血管紧张素II受体阻滞剂(ARB)药品（“沙坦”类药物）中，此类药品用于治疗心力衰竭和高血压⁴。 研究人员怀疑在ARB药物中还可能存在其它三种N-亚硝胺，即N-亚硝基乙基异丙胺(NEIPA)、N-亚硝基二异丙胺(NDIPA)和N-亚硝基二丁胺(NDBA)⁴。

在相对较低的浓度下（ng/mL级或更低）主动监测这些有害化合物非常重要，需要使用高灵敏度、高选择性分析方法。液相色谱质谱联用(LC-MS)技术已成功应用于对各种基质中的N-亚硝胺进行可靠的鉴定和定量^1,2。 经验证，使用靶向采集，例如串联四极杆质谱仪上的多重反应监测(MRM)模式，能够使N-亚硝胺的定量下限(LLOQ)达到或低于0.1 ng/mL^6,7。还研究了使用高分辨率质谱(HRMS)平台进行N-亚硝胺分析的方法^4,8，并利用精确质量数测量获得了更高的特异性。

本文展示了使用Xevo G2-XS QTof上的Tof-MRM采集模式对六种N-亚硝胺（NDMA、NDEA、NDIPA、NEIPA、NMBA和NDBA）进行高灵敏度、高选择性检测的能力。该方法利用四极杆分离已知的前体分子，然后靶向增强指定的母离子或子离子。与典型的全扫描MS相比，这种组合提高了N-亚硝胺的选择性和灵敏度，并利用HRMS固有的精确质量数测量额外增加了特异性优势。

使用ACQUITY UPLC I-Class系统与配备Ion Sabre II APCI探头的Xevo G2-XS QTof质谱仪对NDMA、NMBA、NDEA、NDIPA、NEIPA和NDBA进行分析。使用UNIFI科学信息系统进行数据采集、处理和查看，该系统是一套全面的信息学平台，其中包含与GxP合规性有关的功能，例如数据可追溯性和高级安全性⁹。 使用之前所述的液相色谱方法⁶和ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（部件号：186003539），实现了6种亚硝胺的分离（如图1所示）。 表1显示了该分析所用的LC-MS条件。确定保留时间和最佳离子传输设置后，使用Tof MRM采集模式开发出靶向QTof方法。Tof MRM通过按时间分段选择指定的母离子质量数来操作，在四极杆中将这些母离子分离，随后送至碰撞室，在碰撞室中发生离子传输或碰撞诱导解离(CID)。之后通过Tof区域中的推斥极同步对用户指定的m/z值进行靶向信号增强¹⁰。 再对所有离子进行精确质量数测量，并利用UNIFI软件生成指定m/z值下的提取离子流图。在本研究的N-亚硝胺化合物中，对NDMA、NMBA、NDIPA、NEIPA和NDBA的母离子和选定子离子进行靶向增强。对于NDEA，由于信号强度高，因此仅对母离子进行靶向增强。图2显示了最终Tof MRM采集方法，在方法开发过程中通过实验确定了优化的碰撞能量。

使用两个稀释系列（浓度范围为0.01～100 ng/mL），在每个点重复进样三次（共进样6次），评估所开发方法的定量性能。表2列出了所得的检测下限和定量下限（LLOD/LLOQ）、线性范围和R²值，表明该方法对本文所研究的6种N-亚硝胺具有亚ng/mL级检测能力。两个QC水平（1.25 ng/mL和12.5 ng/mL）下NDMA和NDEA的更多测量结果见图3。从图中可以看出，这两种化合物在两个水平下均得到了准确、精密的测量。计算5次重复进样的平均浓度，两种化合物的平均浓度均在实际浓度的15%以内（图3a和3b）。此外，根据计算出的浓度可知，两个QC水平下NDMA和NDEA的%RSD均小于7%。这些数据表明，使用开发的UPLC-Tof MRM MS方法能够对这两种引人关注的N-亚硝胺进行可靠的定量分析。

潜在致癌物N-亚硝胺的分析方法需要具有足够高的灵敏度才能准确测量亚ng/mL级浓度。本研究证明，使用Xevo G2-XS QTof MS上的Tof MRM与UPLC色谱分离相结合，能够使NDMA、NDEA、NMBA、NMBA、NDIPA、NEIPA和NDBA的LLOQ水平达到或低于0.5 ng/mL。还证明该方法能够在两个QC水平下对低至ng/mL级的NDMA和NDEA进行可靠、准确的定量测量（偏差在15%以内）。总而言之，ACQUITY UPLC系统与Xevo G2-XS QTof质谱仪和UNIFI科学信息系统联用，为N-亚硝胺的定量分析提供了一种符合GxP要求、高灵敏度、高选择性、高特异性的现代化HRMS平台。

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