用于类固醇UPLC-MS/MS分析的MetaboQuan-R方法

本研究开发出一种快速、靶向的UPLC-MS/MS方法，可用于对人血浆/血清中的14种内源性类固醇进行半定量分析。该研究方法经证实适用于分析人血浆/血清中生理相关水平的分析物。MetaboQuan-R方法在同一套通用LC-MS平台上经过优化，该平台之前已用于分析各种化合物，包括胆汁酸、氨基酸、游离脂肪酸、胰蛋白酶肽、酰基肉碱、色氨酸代谢物和各种脂质。这种新的类固醇分析方法进一步扩展了MetaboQuan-R方法套件，能够在靶向多组学工作流程序列运行中分析更多的代谢物和脂质。

优势

• 可在10 min内通过单次运行同时分析14种类固醇
• 可分离主要同量异位化合物
• 高通量分析意味着可以对更多的样品组进行快速分析
• 一个无需衍生化的简易分析流程
• 利用灵活的LC-MS配置实现从一种化合物到另一种化合物的多功能切换

类固醇激素及相关化合物是极其重要的生物活性分子，与无数种基本的生物学功能有关（图1）。这些分析物的分析非常棘手，因为其中许多化合物的化学结构极为相似，会产生多种同量异位物质干扰。由于这些干扰（同量异位）物质具有化学相似性，因此进行有效的色谱分离对于选择性分析至关重要。通常通过延长色谱运行时间、衍生化或使用多种靶向分析方法来实现分离。    

本文将介绍一种高通量UPLC-MS/MS研究方法(MetaboQuan-R)，该方法无需借助衍生化即可对人血浆/血清样品中的14种类固醇进行半定量分析，并使用一款通用、灵活的LC-MS平台，该平台之前已用于多种其它内源性化合物类别。因此，可通过单次运行对多种代谢物类别进行高通量定量分析。

人血浆样品制备

按照之前所述的方法制备人血浆/血清样品（图1）。简而言之，使用乙酸乙酯/己烷混合溶剂通过液/液萃取法制备样品。蒸发后，将所得残留物溶于甲醇/水混合液，然后进行UPLC-MS/MS分析。

UPLC条件

使用配备CORTECS T3 2.7 μm (2.1 × 30 mm)色谱柱（柱温维持在60 ˚C）的ACQUITY UPLC I-Class系统（固定定量环）进行UPLC分离。将5 μL等分试样注入色谱柱中，在反相梯度条件下进行洗脱，其中流动相A为含0.2 mM甲酸铵的0.01%甲酸水溶液，流动相B为含0.01%甲酸和0.2 mM甲酸铵的50%异丙醇乙腈溶液。在初始2.7分钟保持15%流动相B后，在4.3分钟内以线性梯度将流动相B由15%增加至40%进行分离处理，再用98%流动相B以0.45 mL/min的流速清洗色谱柱1分钟。接下来重新平衡色谱柱，使其恢复初始条件。

MS条件

使用Xevo TQ-S micro质谱仪进行多重反应监测(MRM)分析来检测类固醇。所有实验均在正离子电喷雾电离(ESI+)模式下进行。离子源温度和毛细管电压保持不变，分别设置为150 ˚C和2.0 kV。锥孔气流速为50 L/h，脱溶剂气温度为650 ˚C。所用的MRM通道详见表1。

信息学软件

利用MassLynx中的Quanpedia功能将方法信息导入LC-MS系统。这款可拓展且可搜索的数据库不仅可以生成LC和MS方法，还能生成在TargetLynx中用于化合物定量分析的处理方法。 

使用文中所述UPLC-MS/MS平台和提取方案提取、分离并检测出14种类固醇，如表1所示。该列表中包含14种化合物，其中5组化合物（如下列所示）由于结构相似，为同量异位化合物，在质谱仪中会相互干扰。 

A组 – 睾酮和雄烯二酮

B组 – 11-酮基睾酮和11-酮基雄烯二酮

C组 – 醛固酮、可的松、18-羟基皮质酮和皮质醇

D组 – 皮质酮、11-脱氧皮质醇和21-脱氧皮质醇

E组 – 11-脱氧皮质酮和17-羟孕酮

为实现所有类固醇的选择性分析，必须对这些同量异位类固醇组进行色谱分离。使用MetaboQuan-R平台开发的UPLC分离方法成功地将这5组类固醇彼此分离，从而对所有分析物实现特异性分析。图2显示了14种类固醇的UPLC分离结果，其中包括这5组主要同量异位类固醇的分离结果。

图3所示的色谱图显示了两种类固醇17-羟孕酮与11-脱氧皮质酮之间的同量异位物质干扰。我们可以清楚地看到，两种类固醇具有相同的母离子和子离子（MRM通道331.2 > 97.0）。图3中最上方色谱图来自提取的混合人血浆样品，其中显示了17-羟孕酮峰以及其它背景峰，说明类固醇分析需要良好的色谱分离度。该MetaboQuan-R色谱方法不仅能够成功将17-羟孕酮峰与另一种目标干扰类固醇11-脱氧皮质酮分离，还可以将其与至少6种其它未知的内源同量异位物质分离。

本研究开发出一种快速UPLC-MS/MS方法用于对人血浆/血清中的14种内源性类固醇进行研究分析。该方法经证实适用于分析人血浆和血清中生理相关水平的类固醇。该方法利用灵活的反相UPLC-MS/MS平台，可应用于多种化合物类别（包括胆汁酸、游离脂肪酸、氨基酸、胰蛋白酶肽、酰基肉碱和脂质）；因此，该方法可以应用于靶向多组学工作流程中后续运行的部分分析，从而分析多种化合物。

1. Utilizing UPLC Separation to Enable the Analysis of 19 Steroid Hormones in Serum for Clinical Research (Waters Technical Note Number 720006872EN, Wardle et.al).