• 应用纪要

体积排阻色谱法分析单克隆抗体在不同UHPLC系统之间的转移

体积排阻色谱法分析单克隆抗体在不同UHPLC系统之间的转移
  • Zhimin Li
  • Paula Hong
  • Patricia R. McConville
  • Waters Corporation
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摘要

本应用简报介绍将用于单克隆抗体分析的体积排阻色谱法从Agilent 1260 Infinity生物惰性液相色谱系统转移至配备ACQUITY 30 cm单区色谱柱管理器(CM-30S)的ACQUITY Arc Bio系统。 根据液相色谱系统扩散选择合适的SEC色谱柱，在方法转移后获得的保留时间、单体峰面积百分比、高分子量物质、低分子降解物和重现性相当。 

优势

  • 用于mAb分析的SEC方法在ACQUITY Arc Bio系统与Agilent 1260 Infinity生物惰性系统之间无缝转移
  • ACQUITY CM-30S支持使用长度大于25 cm的色谱柱运行传统液相色谱方法和方法开发

简介

使用水性流动相的体积排阻色谱法(SEC)在蛋白质聚集体（高分子量物质，HMWS）的相对定量分析中占有重要地位1。 已有研究表明，蛋白质聚集体与药物的不良免疫作用和疗效降低有关2。 因此，在不同的超高效液相色谱(UHPLC)系统之间进行方法转移时，务必要确保SEC方法能够可重现地定量分析HMWS及其他降解物的含量。 

在方法转移过程中，应考虑的一项重要系统特性是柱外扩散，通常也称为谱带展宽。较大的柱外扩散始终对分离度有不利影响，尤其是SEC分离度，因为该分离是由扩散驱动，与固定相的相互作用非常小，甚至没有3。 针对液相色谱系统选择合适的SEC色谱柱尺寸，可大幅降低柱外扩散的影响4。我们将以SEC方法从Agilent 1260 Infinity生物惰性系统转移到配备CM-30S的ACQUITY Arc Bio系统为例进行详细说明。CM-30S是用于ACQUITY Arc系统的新款色谱柱管理器5。 其保留了支持长色谱柱的能力以便运行传统方法，同时将色谱柱容量扩展为至多15根色谱柱（使用两个CM-30S），允许采用更大尺寸的色谱柱进行方法开发。 

结果与讨论

在液相色谱中，色谱峰谱带展宽约为柱外扩散体积与柱上扩散体积的总和6。 柱外扩散可通过实验确定，用5σec表示，为4.4%峰高处的峰宽与流速的乘积6,7。Agilent 1260 Infinity生物惰性系统的实测5σec为31 µL，配备CM-30S的ACQUITY Arc Bio系统为50 µL。方法转移的关键目标是获得HMWS峰面积百分比的等效定量。按照基于液相色谱系统扩散选择合适SEC色谱柱的指南4，选择固定相粒径为3.5 µm的7.8 mm（内径）× 300 mm SEC色谱柱。

在Agilent 1260 Infinity生物惰性系统(Agilent 1260 Bio)和配备CM-30S的ACQUITY Arc Bio系统上运行曲妥珠单抗（过期后）（一种用于治疗乳腺癌的抗HER2 IgG1 mAb）8的SEC分析。图1显示，在两套系统中观察到相当的色谱图，具有相似的保留时间和分离度。在两张色谱图中，单个HMW峰和低分子量(LMW)峰均与单体主峰实现了基线分离。在单体峰附近观察到未分离的肩峰（标记为“*”）。为进行方法转移，对单体峰进行积分，使其包含此肩峰。 

图1.在Agilent 1260 Infinity生物惰性系统（标记为“Agilent 1260 Bio”）和配备CM-30S的ACQUITY Arc Bio系统上采集的曲妥珠单抗的SEC色谱图。（方法：XBridge BEH SEC 200 Å, 3.5 µm, 7.8 mm × 300 mm蛋白分析专用柱；20 mM磷酸盐缓冲液/350 mM氯化钠，pH 6.8；10 mg/mL曲妥珠单抗，进样体积10 µL；流速0.5 mL/min） 

在单克隆抗体及其他蛋白质药物的产品生命周期中，蛋白质聚集是一个主要问题，它会导致药物发生不良免疫反应和疗效降低。SEC分离的主要目标之一是测量聚集体（即HMW物质）的百分含量。表1显示了两套UHPLC系统得到的HMW与单体之间的平均分离度(Rs)、HMW峰的50%峰高处峰宽以及4.4%峰高处峰宽。在这两套系统之间，HMW与单体之间的分离度以及HMW的峰宽差异可忽略不计。

表1.两套系统间HMW峰与单体峰之间的平均(n=6)分离度(Rs)、HMW峰的50%峰高处峰宽以及4.4%峰高处峰宽比较 

表2汇总了HMW、单体峰和LMW物质的峰面积百分比和重现性。比较结果显示，两套系统间HMW、单体和LMW2的峰面积百分比无差异，所有分析物的RSD百分比差异至多有两个0位(0.00%)。 

表2.两套系统间曲妥珠单抗SEC分离的峰面积百分比（峰面积%）重现性(n=6)比较

配备CM-30S的ACQUITY Arc Bio系统虽然柱外扩散体积大于Agilent 1260 Infinity生物惰性系统，但通过选择合适的SEC色谱柱，可大幅降低对SEC分离的影响。柱外扩散相对于柱上扩散足够小；因此，在这两套UHPLC系统之间获得了等效的分离结果。 

结论

本研究成功将用于mAb分析的SEC方法从Agilent 1260 Infinity生物惰性UHPLC系统转移至配备ACQUITY 30 cm单区色谱柱管理器(CM-30S)的ACQUITY Arc Bio系统。两套系统间的关键质量属性，即HMW物质的峰面积百分比差异，在0.00%以内。所有物质的峰面积百分比重现性在0.00% RSD以内。 

配备CM-30S的ACQUITY Arc Bio系统可轻松适应传统SEC分析中通常采用的7.8 mm（内径）× 300 mm（长）色谱柱。本应用简报证明，ACQUITY Arc Bio系统可重现聚集体、单体和片段的高分离度分离，并实现准确定量。此外，通过在ACQUITY Arc Bio系统中配备两个CM-30S，色谱柱容量可扩展为至多15根色谱柱，有利于在现代化UHPLC系统上采用更大尺寸的色谱柱进行方法开发。   

参考资料

  1. Hong, P.; Koza, S.; Bouvier, S. Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein biotherapeutics and their Aggregates.J. Liq.Chromatogr. Relat.Technol., 2012, 35, 2923–2950. 
  2. Rosenberg, AS.Effects of Protein Aggregates: An Immunologic Perspective.The AAPS Journal, 2006, 8:501–7. 
  3. Iraneta, P.; Koza, S. 在UPLC、UHPLC和HPLC色谱系统上使用BioResolve SEC mAb色谱柱对mAb聚集体、单体和碎片进行高分离度体积排阻色谱分离. 沃特世应用纪要, 2020, 720006956ZH.
  4. Koza, S.; Reed, C.; Chen, W. LC系统扩散对单抗聚集体和片段SEC分析的影响：基于方法选择理想色谱柱规格.沃特世应用纪要, 2019, 720006336ZH.
  5. Instrument Specifications, ACQUITY Arc System, Waters Spec Sheet, 720005400EN.
  6. Koza, S.; Reed, C.; Chen, W. 评估LC系统扩散对体积排阻色谱分析蛋白的影响.沃特世应用纪要, 2019, 720006337ZH.
  7. Hong, P.; McConville, P. 延迟体积与柱外体积的定义及其如何影响方法转换. 沃特世白皮书, 2016, 720005723ZH.
  8. Koza, S.; Hong, P.; Fountain, KJ.Size-Exclusion UltraPerformance Liquid Chromatography Method Development for the Analysis of the Degradation Products of the Trastuzumab Antibody.Waters Application Note, 2012, 720004416EN.

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