摘要
我们开发出一种稳定的分析方法，用于检测和定量复合维生素片及饮料中的10种水溶性维生素和咖啡因。Arc HPLC-PDA系统结合XSelect HSS T3 XP分析柱，能够在16 min内分离10种维生素和咖啡因。通过评价方法线性、准确度、重现性和稳定性，评估该系统和方法用于膳食补充剂和饮料产品常规分析的性能。
优势
- 一种高效的复合维生素片和维生素饮料检测方法，分析可在16 min内完成
- Arc HPLC-PDA系统结合XSelect HSS T3 XP色谱柱发挥优异的重现性、准确度和精密度
简介
维生素对于维持人体健康和促进生长至关重要。饮食摄入可能不足以获得每日所需的维生素含量。因此，许多制造商生产补充剂（包括复合维生素片和维生素增强饮料）来帮助消费者获得必需的含量。市面上许多热销产品（例如果汁、维生素水、功能饮料和运动饮料）都含有几种复合维生素。
美国食品药品监督管理局(FDA)规定了推荐的维生素摄入量，并要求准确编写产品标签，为消费者提供重要信息，以防服药过量或过度摄入。食品和饮料制造商必须清晰标明产品中含有的维生素化合物、色素及其他添加剂。制造商必须遵守严格的法规要求，例如有关在食品中添加维生素和矿物质的欧盟法规(EC) No.1925/20061，或美国联邦法规(CFR)第21篇第101条 - 食品标签2和第104条 - 食品营养质量指南3。食品和饮料制造商在产品配制完成后，需要采用快速、可靠且具有成本效益的方法来分析产品营养成分，确保标示量正确无误4。
本应用纪要将概述一种稳定的分析方法，该方法开发用于检测和定量复合维生素片及维生素增强饮料中的10种水溶性维生素和咖啡因。分离过程使用Arc HPLC-PDA系统结合XSelect HSS T3 XP分析柱完成。
实验
材料与试剂
标准品和缓冲盐
维生素、咖啡因标准品和磷酸二氢钠购自Sigma-Aldrich。
磷酸购自Honeywell Research Chemicals。
复合维生素片和维生素饮料样品购自当地（美国马萨诸塞州）。
样品前处理
标样制备
用水制备大多数维生素和咖啡因单标，浓度为10 mg/mL；用100 mM氢氧化钠制备叶酸、生物素和核黄素标样。标准储备液储存于4 °C。用水连续稀释，制得浓度为100 µg/mL的维生素和咖啡因混标。标准曲线范围为0.4~100 µg/mL。由于抗坏血酸与其他维生素混合时不稳定，因此需要新鲜制备标准曲线混标以供分析。
成人和儿童复合维生素
将单独的成人和儿童复合维生素片一式三份分别放入50 mL离心管中，加入等份的水(50 mL)。将样品振摇10 min，然后离心5 min。收集上清液，再向沉淀物中加入50 mL水。将样品振摇10 min，离心5 min。收集上清液，并与第一份上清液合并。向沉淀物中加入20 mL 100 mM氢氧化钠，再振摇10 min，然后离心5 min。单独收集上清液并进样。样品中的维生素浓度各不相同；因此，通过减小样品稀释倍数，分别使用1 μL和10 μL的进样体积定量样品。
维生素饮料
用0.2 μm PVDF针式过滤器过滤维生素增强饮料。样品中的维生素浓度各不相同。因此，不进行样品稀释，使用1 μL和10 μL的进样体积定量样品。
液相色谱条件
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液相色谱系统： |
Arc HPLC系统 |
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检测： |
PDA单波长，205 nm，254 nm 2998 PDA谱图，200~400 nm，分辨率1.2 nm |
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样品瓶： |
聚丙烯材质12 × 32 mm螺纹口样品瓶（部件号186005220） |
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过滤器： |
针式过滤器0.2 μm PVDF（部件号：WAT200806） |
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色谱柱： |
XSelect HSS T3 XP色谱柱, 100 Å, 2.5 µm, 4.6 mm x 150 mm（部件号：186006741） |
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柱温： |
30 °C |
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样品温度： |
5 °C |
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进样体积： |
1 μL和10 μL |
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流速： |
1.0 mL/min |
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流动相A： |
25 mM磷酸钠，pH 3.0 |
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流动相B： |
甲醇 |
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弱清洗液： |
95:5水:甲醇 |
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强清洗液： |
50:25:25乙腈/水/异丙醇 |
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密封件清洗液： |
95:5水:甲醇 |
Gradient Table
数据管理
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色谱软件： |
Empower 3色谱数据软件(CDS) |
结果与讨论
以不同的流动相、pH条件和温度条件开展多次实验，评估水溶性维生素和咖啡因分析的方法条件。在分离方法中选择25 mM磷酸钠(pH 3)和柱温30 °C。评估维生素和咖啡因的吸光度以确定各种维生素的最大吸收。除泛酸钙(B5)和生物素(B7)只能在205 nm波长下检出外，大部分维生素都能在254 nm和205 nm的波长下检出。为缩短分析时间，本研究采用吸收波长205 nm和254 nm来分析维生素和咖啡因。维生素和咖啡因的保留时间和紫外吸光度如图1所示。
图1.205 nm和254 nm波长下，10种维生素和咖啡因的分离结果
标准曲线：线性、峰面积精密度和保留时间
用水连续稀释水溶性维生素和咖啡因，制备多点标准曲线。标样重复制备两份，每个浓度水平重复进样6次。生成的标准曲线范围为0.4~100 µg/mL，表现出良好的线性(R2 > 0.999)。约4 h后观察到抗坏血酸（维生素C）降解(R2 > 0.9983)。由于维生素C的稳定性不佳，因此其标样在制备后立即运行，以获得该化合物的线性曲线。维生素和咖啡因的标准曲线如图2所示。
图2.205 nm紫外波长下，10种维生素和咖啡因在0.4~100 µg/mL范围内的标准曲线
计算维生素和咖啡因LOD与LOQ所依据的信噪比(s/n)分别为3:1和10:1，是利用Empower软件测得的峰到峰结果。s/n值通过分析205 nm和254 nm下的紫外吸光度获得。在254 nm波长下计算s/n所用0.4 µg/mL样品的代表性色谱图显示了大多数维生素的LOQ水平（图3）。不同浓度水平生物素、泛酸钙和氰钴胺的s/n使用205 nm波长数据获得。表1汇总了维生素和咖啡因的LOD、LOQ和峰拖尾因子。
图3.254 nm波长下，维生素和咖啡因校准标样(0.4 µg/mL)的代表性色谱图以及LOQ和LOD浓度水平下的s/n
表1.205 nm和254 nm紫外波长下，维生素和咖啡因的LOD和LOQ
标准曲线各浓度水平下的保留时间和峰面积重现性按%RSD计算。大多数维生素和咖啡因的保留时间%RSD约为0.8%，维生素C除外，约为2%。大多数维生素的峰面积%RSD低于2%。保留时间精密度(%RSD)和峰面积精密度(%RSD)结果如图4A和4B所示。
图4A.不同浓度标样中一些维生素的保留时间精密度(%RSD, n = 6)。B.不同浓度标样中一些维生素的峰面积精密度(%RSD, n = 6)。
方法稳定性
温度和pH影响：
在不同温度（28 °C、30 °C和32 °C）下评估方法性能。
当温度增加至32 °C时，大部分维生素和咖啡因仍保持良好的分离度。但是，烟酰胺和吡哆醇之间的分离度随温度升高而降低。结果如图5A所示。
在不同pH水平（pH 2.8、pH 3.0和pH 3.2）下评估方法性能。
当pH增加至pH 3.2时，大部分维生素和咖啡因仍保持良好的分离度。硫胺素和抗坏血酸（维生素C）之间的分离度随pH值升高而降低。结果如图5B所示。
图5A.205 nm紫外波长下，温度对烟酰胺与吡哆醇分离度的影响。B. 254 nm紫外波长下，pH对硫胺素与抗坏血酸分离度的影响。
色谱柱使用寿命和压力迹线
集中使用该色谱柱评估分离方法以及分析的维生素产品的条件。色谱柱使用寿命的重现性是基于在初始梯度进样和大约800次进样后，100 µg/mL新鲜标样的保留时间；再次进样分析100 µg/mL新鲜标样。监测从第120次进样到第1000次进样的色谱柱压力迹线；在第1000次进样时，压力增加约200 psi。评估色谱柱使用寿命的代表性色谱图如图6A所示，压力迹线如图6B所示。
图6A.在相同梯度下进样700次后的色谱柱性能。B.在相同梯度下进样1000次后的色谱柱压力迹线。
残留
图7A显示了儿童用维生素片3次进样前后的空白进样色谱图。图7B显示了100 µg/mL维生素和咖啡因混标进样前后的空白进样色谱图。未在这些样品中观察到残留。
图7A.儿童用维生素残留观察。B. 100 µg/mL维生素和咖啡因残留观察。
复合维生素片和饮料分析
成人和儿童用复合维生素片中10种维生素的定量分析结果如表2所示。样品来自不同制造商，包含多种不同浓度的维生素。1 µL进样体积用于定量样品中的高浓度维生素，例如维生素C；10 µL进样体积用于定量样品中的生物素及其他低浓度生维生素。较小的进样体积可用于浓缩样品，以减少样品稀释需求。但是，如果样品中含有极高浓度的维生素和咖啡因，则需要稀释样品以拟合线性曲线。在之前的研究中考察过Arc HPLC进样器的进样体积，结果表现出优异的线性和精密度5。
表2.维生素片产品的定量分析结果(n = 3)
将维生素片用50 mL水萃取2次，以提取水溶性维生素和咖啡因。然后用20 mL 100 mM氢氧化钠提取生物素、叶酸和核黄素，将提取的上清液单独进样，检测溶于氢氧化钠中的维生素。维生素片中氰钴胺(B12)和生物素(B7)的浓度均低于方法检测限和定量限。在205 nm和254 nm波长下分析成人用维生素片所得到的代表性色谱图如图8所示。
图8.依次用水和100 mM氢氧化钠萃取成人用复合维生素片，并在205 nm紫外波长下分析所得到的色谱图。
本研究分析了一些热销饮料（例如维生素增强水、运动饮料和功能饮料）中的维生素和咖啡因浓度。进样体积为1 µL和10 µL，在不稀释样品的情况下直接进样分析。饮料中氰钴胺(B12)的浓度低于该方法对氰钴胺的检测限和定量限。结果见表3，分析功能饮料所得到的代表性色谱图见图9。
表3.维生素饮料产品的定量分析结果(n = 3)
图9.在205 nm紫外波长下分析功能饮料所得到的色谱图
结论
Waters ARC HPLC-PDA系统结合XSelect HSS T3 2.5 µm色谱柱，能够在16 min内分离10种维生素和咖啡因。
该方法表现出优异的线性、精密度和准确度。
XSelect HSS T3 XP色谱柱表现出优异的保留时间和柱压重现性。
该分析工作流程适用于在以下方面为饮料制造商提供支持：
- 各种复杂水溶性维生素的标准化分析。
- 尽量避免维生素及其他原料过量。
- 减少所需的方法数量。
- 快速确认营养价值、维生素规格和标签合规性。
参考资料
- 网站：http://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2006:40 4:0026:0038:EN:PDF.
- 网站：http://ecfr.gpoaccess.gov/cgi/t/text/text-idx?c=ecfr;sid=ea70279dd46.
- 网站：http://ecfr.gpoaccess.gov/cgi/t/text/text-idx?c=ecfr;sid=ea70279dd46.
- Benvenuti M, Riches E. The Rapid Analysis of 10 Water-Soluble Vitamins, Caffeine, and Six Common Food Dyes using ACQUITY UPLC with UV Detection.Waters Application Note, 720003188EN, 2009.
- Yang J, Rainville P. 采用配备PDA检测器的Arc HPLC系统在不受阿斯巴甜降解物干扰的条件下分析软饮料添加剂.沃特世应用纪要, 720007219ZH, 2021.
720007357ZH，2021年9月
