• 应用纪要

HPLC-MS测定聚山梨酯20制药原料中的脂肪酸组成

HPLC-MS测定聚山梨酯20制药原料中的脂肪酸组成
  • Margaret Maziarz
  • Paul D. Rainville
  • Waters Corporation
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摘要

聚山梨酯是一种非离子表面活性剂，广泛用作食品和药品中的辅料。由于其质量和纯度与药品安全性和患者健康相关，因此应采用适当的检测方法进行质量保证和控制。美国药典规定使用气相色谱(GC)-火焰离子化检测器(FID)方法分析聚山梨酯20，该方法将甲基化酸转化为游离脂肪酸，然后基于脂肪酸组成进行分析（美国药典国家处方集(USP–NF)2021第1版）。本研究提出了一种HPLC-MS联用方法来分析聚山梨酯20制药原料，新方法使用质谱检测技术测量脂肪酸组成，无需执行复杂的样品前处理程序，可实现快速直接的分析。 

优势

  • 通过HPLC-MS联用方法测量脂肪酸组成，快速评估聚山梨酯20制药原料质量
  • 使用ACQUITY QDa检测器进行质谱检测的无发色团脂肪酸分析技术简单直接
  • Arc HPLC系统具有稳定、可靠和可重现的性能

简介

聚山梨酯是一种非离子表面活性剂，业界表述常使用商品名“吐温”1–3， 在药品生产中广泛用作乳化剂、稳定剂、润湿剂、增溶剂和分散剂3。

聚山梨酯是多种组分的复杂混合物，由饱和及/或不饱和脂肪酸的聚氧乙烯失水山梨醇单脂组成1。 不同类型聚山梨酯的区别在于脂肪酸侧链和酯化程度。由于其复杂性和异质性，聚山梨酯分析可能是一项艰巨的任务。此外，聚山梨酯缺乏UV检测所需的强发色团。针对主要聚山梨酯亚种的分析和表征已经开发并应用了多种分析技术，例如液相色谱(LC)结合电雾式检测器(CAD)、蒸发光散射检测器(ELSD)和质谱法1–3。 其他技术则利用气相色谱(GC)结合质谱检测与核磁共振(NMR)进行分析2。 若干文献报告方法能够定量单个聚山梨酯峰，但未能对所有脂肪酸提供专属性2。

聚山梨酯20在乳剂和混悬剂药品中广泛用作稳定剂，在滴眼液中用作润滑剂4。 美国药典建议采用气相色谱-火焰离子化检测器(FID)方法，先将甲基化酸转换为游离脂肪酸，再基于脂肪酸组成分析聚山梨酯205。 该方法需要将聚山梨酯水解并衍生化为游离脂肪酸，此过程复杂且耗时，并不是QC实验室进行常规检测的理想方法。

本研究提出了一种基于脂肪酸组成分析聚山梨酯20制药原料的快速HPLC-MS方法（表1）。该方法可直接进样，省去复杂的样品前处理程序且无需使用气相色谱仪，快速准确地分析脂肪酸。

表1.USP专论规定的聚山梨酯20所含脂肪酸5。 C-C：碳-碳链长度。

实验

脂肪酸、聚山梨酯20和质谱级溶剂购自Sigma。

样品描述

用乙醇制备浓度为1 mg/mL的脂肪酸标准储备液。用水/乙醇(50:50, v/v)混合溶液将标准储备液稀释至浓度20 µg/mL。

用1 M氢氧化钾水溶液水解聚山梨酯20供试品以释放出脂肪酸。将用1 M氢氧化钾制得的1.5 mg/mL供试品溶液在40 °C下温育6 h，然后用等体积1 M甲酸中和，用水/乙醇(50:50, v/v)混合溶液稀释至0.1 mg/mL，临分析前用PVDF针式过滤器过滤。

方法条件

液相色谱条件

液相色谱系统：

Arc HPLC系统、带制热/冷功能的柱温箱（配备被动预加热器）、ACQUITY QDa检测器、等度溶剂管理器(ISM)

样品瓶：

LCMS最大回收样品瓶，容积2 mL（部件号：600000670CV）

色谱柱：

XBridge BEH C18, 4.6 × 100 mm, 3.5 µm（部件号：186003033）

柱温：

60 °C

样品温度：

10 °C

进样体积：

25 µL

流速：

2.0 mL/min

流动相：

溶剂A：10 mM乙酸铵水溶液

溶剂B：乙腈

清洗溶剂：

灌注/样品清洗液：60:40水/乙腈

密封件清洗液：90:10水/乙腈

梯度表

质谱条件

质谱系统：

ACQUITY QDa检测器，Performance版本

电离模式：

ESI-

采集范围：

75–350 m/z

单离子扫描(SIR)：

115.1, 143.1, 171.2, 199.2, 227.3, 279.3, 255.3, 281.3, 283.3 m/z

探头温度：

600 °C

毛细管电压：

0.5 kV

锥孔电压：

10 V

等度溶剂管理器(ISM)条件

补偿溶剂：

50:50水/乙腈（含1 mM乙酸铵）

流速：

0.2 mL/min，分流和稀释比为10:1

数据管理

色谱软件：

Empower 3 FR4SR2

结果与讨论

本研究所用方法通过水解聚山梨酯20释放出脂肪酸，然后进行反相分离并使用质谱检测法测定脂肪酸组成。

饱和脂肪酸缺乏发色团（或双键），因此无法使用UV检测（表1）。虽然不能直接使用UV检测，但可以在ACQUITY QDa检测器上产生稳定的信号。MS总离子流色谱图(TIC)展示了ESI-模式下在m/z 75–350质量范围内检测到的所有峰（图1A）。从ACQUITY QDa检测器得到的质谱数据有助于快速鉴定脂肪酸。单离子扫描(SIR)模式可测定单个目标离子的强度（图1B），增强目标化合物的信号并简化其分析，因此在定量分析中使用单离子扫描(SIR)模式测量脂肪酸。

图1.利用ACQUITY QDa检测器分析游离脂肪酸。样品为20 µg/mL的标准品溶液。A：总离子流色谱图(TIC)，B：单离子扫描(SIR)通道叠加图。

利用等度溶剂管理器(ISM)6分流并稀释进入ACQUITY QDa检测器的液流。在柱后添加ISM补偿（稀释）溶剂，并与进入离子源的液流混合。研究期间筛选了包含乙腈、甲醇和乙酸铵缓冲液的各种ISM补偿溶剂，旨在增强MS信号，同时确保重复进样获得可接受的重现性。例如，包含乙腈和乙酸铵的补偿溶剂（图2）提供了稳定的脂肪酸信号，且重复进样(n = 5)具有可接受的重现性。与研究期间筛选的其他补偿溶剂相比，使用1 mM乙酸铵补偿溶剂所得到的峰面积%RSD较低。 

图2.ISM补偿溶剂筛选，旨在增强MS信号和方法性能。A：乙腈/水(50:50 v/v)，B：甲醇/水(50:50 v/v)，C：含1 mM乙酸铵的乙腈/水(50:50 v/v)。20 µg/mL脂肪酸标准品的MS SIR数据。

系统适应性

按照USP通则<621>“色谱法”中列出的质量标准，通过评估20 µg/mL脂肪酸标准品（图3）6次重复进样的系统适应性来衡量方法性能7。 该方法成功分离出所有脂肪酸，且各峰之间的USP分离度(Rs) ≥4.2。保留时间和峰面积的重现性(%RSD)范围分别为0.13~0.62%和1.29~4.19%。

图3.20 µg/mL脂肪酸标准溶液6次重复进样的系统适应性评估结果。MS SIR数据。

聚山梨酯20分析

使用Empower软件，通过比较色谱进样中各脂肪酸的峰面积与所有脂肪酸的总面积，计算聚山梨酯20样品中各脂肪酸的百分比(%)。按照有关聚山梨酯20的USP专论进行计算5。 聚山梨酯20样品溶液中脂肪酸组成的结果符合USP标准（图4）。 

图4.聚山梨酯20供试品溶液中脂肪酸组成的测定结果（平均值，n = 6）。*标准参考有关聚山梨酯20的USP专论5。

结论

本研究开发的HPLC-MS方法能够快速测定聚山梨酯20中的脂肪酸组成，并且无需对供试品进行复杂的水解和衍生化程序。通过质谱检测得到的质谱数据有助于准确快速地鉴定分析物。新方法可准确评估聚山梨酯20制药原料的质量和纯度，同时提高样品组分确认的可信度。

总体而言，Arc HPLC是一种现代仪器，提供了强大的性能、高进样精度、低残留和高反压耐受性。ACQUITY QDa检测器是一款稳定且简便易用的质谱检测器，可提供准确可靠的结果。这些技术可轻松应用于QC实验室中制药原料的常规检测。

参考资料

  1. Borisov OV, Ji JA, Wang YJ, Vega F, Ling VT.Toward Understanding Molecular Heterogeneity of Polysorbates by Application of Liquid Chromatography-Mass Spectrometry with Computer-Aided Data Analysis.Analytical Chemistry, 2011, 3934–3942:83.
  2. Martos A, Koch W, Jiskoot W, Wuchner K, Winter G, Friess W, Hawe A. Trends on Analytical Characterization of Polysorbates Their Degradation Products in Biopharmaceutical Formulations.Journal of Pharmaceutical Sciences, 2017, 1722–1735:106.
  3. Wang Z, Wang Y, Tie C, Zhang J. A Fast Strategy for Profiling and Identifying Pharmaceutical Excipient Polysorbates by Ultra-High Performance Liquid Chromatography coupled to High-Resolution Mass Spectrometry.Journal of Chromatography A, 2021, 460450:1609.
  4. https://go.drugbank.com/drugs/DB11178.
  5. USP Monograph for Polysorbate 20, United States Pharmacopoeia, USP–NF 2021 Issue 1.The United States Pharmacopoeia Convention, Official 01-May-2020.
  6. ACQUITY等度溶剂管理器概述和维护指南.沃特世用户指南, 715004208ZH, 修订版A, 2013.
  7. USP General Chapter, <621>, Chromatography, USP–NF 2021 Issue 1, The United States Pharmacopeia Convention, Official 01-August-2017.

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720007336ZH，2021年8月

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