使用直通式SPE和UPLC-MS/MS测定谷物、坚果、无花果和动物饲料中的管制真菌毒素及新型真菌毒素
摘要
真菌毒素可通过收获前和收获后的污染机制天然存在于各种食品中，在全球范围内受到监管。本文介绍了一种多毒素分析方法，采用先执行快速简单的直通式SPE净化，后实施LC-MS/MS分析的方式，在谷物类产品、花生和坚果、无花果干和动物饲料中分析31种管制真菌毒素和新型真菌毒素。
之所以开发该方法，是希望提高回收率并增强易用性。该方法的性能已在加标样品上验证，并通过可用的参比物质得到确证。
该方法在正确度和重现性方面提供了非常出色的性能，黄曲霉毒素和赭曲霉毒素A的方法LOQ分别低至0.25 µg/kg和1.0 µg/kg。
Oasis PRiME HLB SPE净化发挥了明显优势，它采用简单快速的直通式方案，避免了SPE活化、平衡和清洗步骤。所有分析物均表现出优异的回收率（范围60%~108%），证明该净化方案的适用范围宽，这是使方法能够视需要扩展以适用于更多化合物的要件。
优势
- 使用一种方法即可分析更多复杂基质中的多种真菌毒素
- 使用直通式SPE净化去除主要共提取物
- 对所有被测真菌毒素均表现出良好的方法性能，满足法规要求
- 方法可扩展至更多分析物和不同食品和饲料基质
简介
真菌毒素是真菌的次生代谢物，对人类或动物有毒，可能存在于多种食品和饲料商品中。全球多数国家/地区在经过毒性、发生率和消费数据以及经济和政治方面的全面风险评估后，都对常见真菌毒素实行了管制。相关法规通常对各种食品和饲料商品中真菌毒素的最高限量或指导值做出了规定。全球不同地区适用的真菌毒素法规限量和标准各不相同1。 在食品中，由于真菌毒素具有严重毒性，因此最高限量值极低。此外，预计未来几年内法规将不断发展；预计未来的法规将更新最高限量，并且纳入更多新型真菌毒素，包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇改性形式、恩镰孢菌素和交链孢霉毒素。
我们开发出一种简单快速的样品前处理方案和LC-MS/MS分析方法，在三种不同食品类型（谷物、坚果、无花果）和动物饲料中分析了31种管制真菌毒素和新型真菌毒素，本文阐述了相关性能。Oasis PRiME HLB是一种直通式固相萃取(SPE)小柱，用于去除一些主要干扰物，从而提高方法稳定性2。 亲水亲脂平衡共聚物(HLB)无需经过任何溶剂化、平衡或活化步骤，因此可以节省时间和溶剂费用。
实验
样品描述和预处理
小麦粉、花生、无花果和动物饲料（宠物饲料混合物）购自当地市场。提取前，使用分析型研磨机(IKA)研磨约200 g各种食品类商品使其均质化。参比物质包括玉米粉、榛子（水/坚果浆液）、无花果干（水/水果浆液）和动物（牛）饲料，均购自Fera Science Ltd (FAPAS)。
样品提取与净化
所有基质的样品前处理方案一致，如图1所示。
图1.样品前处理方案
称取一部分均质化代表性样品(5 g)加入50 mL塑料离心管中。在涡旋器中，将样品用20 mL含0.5%乙酸和0.2%甲酸(v/v)的乙腈:水(80:20)萃取10 min。以>5000 g速率离心后，取第一部分上清液(0.4 mL)上样至Oasis PRiME HLB小柱（3 cc，150 mg，部件号186008717），再通过干燥柱床的方式弃去（即，泵送3 mL空气通过小柱）。取第二部分上清液(1.2 mL)上样，收集洗脱液。然后将纯化后的提取物用水按1:5的比例直接稀释到液相色谱样品瓶中供LC-MS/MS分析（即，200 µL纯化后的提取物与800 µL水混合），使总稀释倍数为20倍。稀释后，用内径为13 mm的1.2 µm玻璃纤维针式过滤器过滤提取物。使用基质匹配标准品定量。
LC-MS/MS条件
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色谱系统： |
ACQUITY UPLC I-Class PLUS系统 |
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自动进样器： |
流通针式(FTN)进样器，配备15 µL进样针和50 µL扩充定量环（部件号：430002012），安装在进样阀端口4与APH之间 |
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色谱柱： |
ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 × 100 mm，粒径1.7 µm，孔径130 Å，部件号：186002352） |
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水性流动相： |
1 mM乙酸铵水溶液+0.5%乙酸+0.1%甲酸(v/v) |
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有机流动相： |
甲醇+0.5%乙酸+0.1%甲酸 |
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洗针液： |
水:甲醇:乙腈:异丙醇:丙酮(20:20:20:20)+1%甲酸（体积比） |
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密封清洗溶剂： |
水:乙腈(80:20, v/v) |
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柱温： |
40 °C |
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样品温度： |
15 °C |
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进样体积： |
8 µL |
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流速： |
0.40 mL/min |
表1.UPLC梯度
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质谱系统： |
Xevo TQ-S micro |
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电离模式： |
ESI+/-（极性切换） |
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采集模式： |
多重反应监测(MRM) |
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毛细管电压： |
+0.75/-0.3 kV |
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锥孔气流速： |
50 L/h |
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脱溶剂气温度： |
600 °C |
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脱溶剂气流速： |
1100 L/h |
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离子源温度： |
150 °C |
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分辨率： |
MS1单位，MS2单位 |
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软件： |
MassLynx v4.2（使用TargetLynx XS进行数据处理） |
表2.优化后的MRM通道
方法验证
将31种真菌毒素的混合物以三种浓度水平添加到小麦粉、花生、无花果和动物饲料样品中，一式三份（浓度见表4、5、6和7），以此验证方法的正确度（用回收率表示）和重现性。然后按照上一节所述的方法提取并分析空白和加标样品。根据Eurachem指南3，还分析了一些FAPAS参比物质（玉米粉、榛子、无花果干和动物饲料）的六个重复样来确证方法性能。
结果与讨论
色谱分析
色谱性能符合SANTE/12089/2016指导原则的要求4。 最先洗脱的化合物（雪腐镰刀菌烯醇）的保留时间为2.38 min，是色谱柱死体积所对应保留时间Vd（Vd约0.55 min）的两倍以上。添加了31种真菌毒素的小麦提取物的代表性色谱图如图2所示。根据SANTE指导原则，样品提取物中分析物的保留时间对应于同一序列中测得的校准标准品平均保留时间，容差为±0.05 min。每个序列内RT的重现性大于±0.03 min。
关键化合物对为：
- 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷(DON-3-Glu)：二者的MRM通道相同，因为DON-3-Glu在离子源中失去了糖基，因此监测通道都为[DON+H]+。本方法使这两种化合物实现了基线分离。
- 3-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-Ac-DON)和15-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-Ac-DON)：这两种异构体在监测和定量时通常视作3-Ac-DON与15-Ac-DON之和，因为它们在反相液相色谱中通常发生部分共流出。使用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1 x 150 mm, 1.8 µm，部件号186003540）或ACQUITY UPLC HSS PFP色谱柱（2.1 x 100 mm, 1.8 µm，部件号186005967）能够分离这两种化合物。如需了解有关乙酰基-DON异构体分离的更多信息，请联系沃特世。
图2.被测真菌毒素的洗脱顺序和代表性色谱图（小麦提取物的基质匹配标准品）
线性、鉴定和定量限
在测试的浓度范围内验证方法线性。标准曲线的决定系数(R2)高于0.9900，残差低于±20%。相比于根据同一序列校准标准品计算的平均离子丰度比，所有被测样品的离子丰度比偏差均在±30%以内。表3报告了根据溶剂标准品计算出的仪器定量限(i-LOQ)（LOQ水平下的信噪比≥10）。表4、5、6和7分别显示了小麦粉、花生、无花果和动物饲料中的方法LOQ (m-LOQ)3和线性范围。该方法的线性范围足以测定被测食品典型法规限量的真菌毒素。
表3.Xevo TQ-S micro上的仪器定量限(i-LOQ)、离子丰度比和保留时间
正确度和重现性
在所有被测的商品类型中，回收率在60%~108%之间，重现性评估条件下的相对标准偏差(%RSDr)低于11%，符合法规推荐值5（见表4、5、6和7）。图3、4、5和6还展示了平均回收率。
表4.小麦粉中的方法LOQ (m-LOQ)、方法线性范围以及三种加标浓度下真菌毒素的回收率百分比(Rec%)±相对标准偏差百分比(%RSDr, n = 3)
表5.花生中的方法LOQ (m-LOQ)、方法线性范围以及三种加标浓度下真菌毒素的回收率百分比(Rec%)±相对标准偏差百分比(%RSDr, n = 3)
表6.无花果中的方法LOQ (m-LOQ)、方法线性范围以及三种加标浓度下真菌毒素的回收率百分比(Rec%)±相对标准偏差百分比(%RSDr, n = 3)
表7.动物饲料中的方法LOQ (m-LOQ)、方法线性范围以及三种加标浓度下真菌毒素的回收率百分比(Rec%)±相对标准偏差百分比(%RSDr, n = 3)
图3.小麦粉中三种加标浓度下被测真菌毒素平均回收率(Rec%)条形图。误差条柱表示相对标准偏差百分比(%RSDr, n = 3)。
图4.花生中三种加标浓度下被测真菌毒素平均回收率(Rec%)条形图。误差条柱表示相对标准偏差百分比(%RSDr, n = 3)。
图5.无花果中三种加标浓度下被测真菌毒素平均回收率(Rec%)条形图。误差条柱表示相对标准偏差百分比(%RSDr, n = 3)。
图6.动物饲料中三种加标浓度下被测真菌毒素平均回收率(Rec%)条形图。误差条柱表示相对标准偏差百分比(%RSDr, n = 3)。
还使用独立参比物质评估了正确度和重现性。玉米粉、榛子/水浆液、无花果干/水浆液和动物饲料参比物质中的计算浓度在±2|z|-得分之间。正确度在71%~99%范围内，重现性(%RSDr, n = 6)在0.5~7%范围内（如表8、9、10和11所示）。
表8.FAPAS玉米参比物质T04366QC中计算浓度的平均值±标准偏差和相对标准偏差百分比(%RSDr, n = 6)。Xa=认定值。计算浓度相对于认定值的正确度(%)。
表9.FAPAS榛子参比物质T04390QC（水/坚果浆液）中计算浓度的平均值±标准偏差和相对标准偏差百分比(%RSDr, n = 6)。Xa=认定值。计算浓度相对于认定值的正确度(%)。
表10.FAPAS无花果干参比物质T04343QC（水/水果浆液）中计算浓度的平均值±标准偏差和相对标准偏差百分比(%RSDr, n = 6)。Xa=认定值。计算浓度相对于认定值的正确度(%)。
表11.FAPAS动物饲料参比物质T04375QC中计算浓度的平均值±标准偏差和相对标准偏差百分比(%RSDr, n = 6)。Xa=认定值。计算浓度相对于认定值的正确度(%)。
结论
我们成功开发出一种多真菌毒素分析方法并验证了方法性能，用于测定11种管制真菌毒素和20种新型真菌毒素，包括黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A、伏马菌素、玉米赤霉烯酮、A型和B型单端孢霉烯毒素、恩镰孢菌素、白僵菌素、杂色曲霉素、桔霉素和交链孢霉毒素。该方法的性能符合欧盟法规No 401/2006和SANTE指导原则中规定的标准。结合简单快速的直通式SPE净化，可有效去除一些主要干扰物，从而提高方法稳定性。
所述方法具有优异的正确度和重现性，使用真菌毒素浓度已知的独立参比物质得到确证。该方法适用于分析各种食品类商品：代表谷物以及高淀粉含量干粮的小麦和玉米；代表花生和坚果以及高脂食品的花生和榛子；代表水果和强极性食品的无花果；以及动物饲料。
最后，由于Oasis PRiME HLB净化产品具有非常广泛的适用性和通用性，因此该方法的分析范围未来可以得到扩展。
参考资料
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- Oasis Cartridges and 96-Well Plates – Care and use Manual（《Oasis小柱和96孔板 – 维护和使用手册》）.沃特世公司（部件号：715001391）.
- Magnusson B. and Örnemark U. (eds.)Eurachem Guide: The Fitness for Purpose of Analytical Methods – A Laboratory Guide to Method Validation and Related Topics, (2nd ed.2014).ISBN 978-91-87461-59-0.
- SANTE/12089/2016.Guidance Document on Identification of Mycotoxins in Food and Feed.Implemented by 01/01/2017.
- Commission Regulation No 401/2006 of 23 February 2006 Laying Down the Methods of Sampling and Analysis for the Official Control of the Levels of Mycotoxins in Foodstuffs.
缩略语列表
AFB1 = 黄曲霉毒素B1
AFB2 = 黄曲霉毒素B2
AFG1 = 黄曲霉毒素G1
AFG2 = 黄曲霉毒素G2
FB1 = 伏马菌素B1
FB2 = 伏马菌素B2
FB3 = 伏马菌素B3
OTA = 赭曲霉毒素A
ZEA = 玉米赤霉烯酮
DON = 脱氧雪腐镰刀菌烯醇
DON-3-Glu = 脱氧雪腐镰刀菌烯醇-3-葡萄糖苷
NIV = 雪腐镰刀菌烯醇
HT-2 = HT-2毒素
T-2 = T-2毒素
3-Ac-DON = 3-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇
15-Ac-DON = 15-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇
DAS = 双乙酸基草镰刀菌醇
NEO = 新茄病镰刀菌烯醇
脱环氧-DON = 脱环氧-脱氧雪腐镰刀菌烯醇
FUS-X = 镰刀菌酮X
AOH-Me-Ether = 交链孢酚单甲醚
720007377ZH，2021年9月
