HILIC可用作在BioAccord系统上进行寡核苷酸完整分子量确认的替代分离模式

HILIC是一种干净、经济有效的分离方法，易于纳入寡核苷酸完整分子量确认的自动工作流程。如本研究所示，BioAccord LCMS系统能够帮助waters_connect用户对小分子和中等分子寡核苷酸（至多50-mer）执行快速准确的完整分子量确认。

优势

• 自动、合规的HILIC LC-MS工作流程经证明能够提供良好的质量精度（低于15 ppm），适合使用HILIC LC-MS分析进行寡核苷酸完整分子量确认
• 在流动相方面，使用HILIC法分离寡合苷酸与传统的离子对反相(IP-RP)分离相比有三大优势：1)流动相成本至少缩减10倍以上，2)毒性显著减弱以及3) LC-MS操作的流动相稳定性至少提升10倍（可稳定长达2周）
• 与采用不锈钢硬件的传统ACQUITY BEH Amide色谱柱相比，采用MaxPeak高性能表面的ACQUITY Premier BEH Amide色谱柱无需色谱柱老化操作，可节省色谱柱钝化时间，开箱即可直接使用

近年来，寡核苷酸类药物开始作为小分子及治疗性蛋白药物的有力补充^1,2。 寡核苷酸类药物的生产和质量控制需要使用高选择性、高灵敏度的LC-MS方法。在寡核苷酸分析中，使用离子对反相色谱法(IP-RP)分离寡核苷酸后进行负离子ESI-MS模式质谱检测是一种广受认可的质谱分析方法。近期有研究使用该寡核苷酸分析方法，介绍了以waters_connect控制BioAccord系统进行数据采集、处理和报告的自动化合规工作流程^3,4。图1展示的BioAccord LC-MS系统是沃特世于2019年推出的一套紧凑、稳定、简便易用的平台，可用于生物药物常规分析。本研究使用的这套完全集成的BioAccord LC-MS系统包含一套ACQUITY UPLC I-Class PLUS系统、一台可变波长紫外(TUV)检测器以及ESI-Tof ACQUITY RDa质谱检测器，如图1所示。

在本研究中，我们使用亲水作用色谱法(HILIC)作为IP-RP的替代分离技术，研究了BioAccord LC-MS系统用于寡核苷酸完整分子量确认的能力。近期发表的两篇文章表明^5,6，HILIC的普及性虽不如IP-RP色谱法，但它在寡核苷酸分析方面展现出独特潜力。HILIC流动相不采用离子对试剂或有毒且昂贵的挥发性改性剂（例如1,1,1,3,3,3-六氟-异丙醇，HFIP），这是考虑采用此替代分离技术的主要原因⁷。本应用纪要中的LC-MS数据来自3种不同的化合物：寡核苷酸polyT标准品(OSTs)、经过修饰的寡核苷酸（全硫代磷酸化25-mer寡核苷酸）以及大分子57-mer寡核苷酸。所有数据集均以全扫描MS模式采集，并在waters_connect中使用BayesSpray质谱电荷去卷积算法进行处理，为每种化合物生成准确的完整分子量测量值。

试剂和样品前处理

醋酸铵试剂（LiChropur，产品目录号5.33004.0050）购自Millipore Sigma（美国密苏里州圣路易斯）。乙腈（LC-MS级，产品目录号34881-1L）购自Honeywell（美国卡罗来纳州夏洛特）。HPLC级去离子(DI)水使用MilliQ系统（密理博公司，美国马萨诸塞州贝德福德）净化。使用溶剂A（10 mM醋酸铵的75%乙腈溶液）溶解MassPREP OST（寡核苷酸分离技术）标准品（沃特世部件号：186004135），制得浓度为10 µM的溶液。25-mer全硫代磷酸化寡核苷酸（25-mer PS寡核苷酸序列：5’-C*T*C*T*C* G*C*A*C*C* C*A*T*C*T* C*T*C*T*C* C*T*T*C*T*-3’）、57-mer寡核苷酸（序列：5’-CAA TAT TTT ACA TGA ACT GGA GGT CCG TCA ATG ACA GTG TAG GCT GGA GCT GCT TCG-3’）均购自Integrated DNA Technologies（艾奥瓦州科尔维尔）。两种寡核苷酸均使用溶剂A（10 mM醋酸铵的75%乙腈溶液）溶解，制得浓度为10 µM的溶液。所有寡核苷酸样品的进样量均为2 µL。

LC-MS系统

BioAccord系统，包含ACQUITY UPLC I-Class PLUS系统、TUV检测器和ACQUITY RDa检测器

本研究使用了常规ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱（部件号：186004800）和近期推出的ACQUITY Premier BEH Amide色谱柱（部件号： 186009504）对Waters MassPREP寡核苷酸混标（OST标准品）进行HILIC分离。新色谱柱属于填充亚2 µm颗粒的色谱柱系列，采用了MaxPeak高性能表面(HPS)技术^8–12。寡核苷酸含有一个带负电荷的磷酸盐骨架，该骨架可与常规UPLC/HPLC色谱柱中常见的金属表面（如不锈钢外壳或筛板）相互作用。这些相互作用是造成寡核苷酸损失（色谱柱回收率低）、色谱峰形不佳或数据重现性差的常见原因。新安装的色谱柱通常需要通过进样一系列高浓度寡核苷酸样品（柱上>20 pmol）来进行色谱柱钝化，从而减少分析物与流路中金属表面的相互作用。

如图2A所示，使用常规的新ACQUITY BEH Amide色谱柱时，需要进样多达6次才能使OST混合物中所含五种主要寡核苷酸的UV响应值保持稳定。虽然首次进样时的上样量极高（柱上进样20 pmol OST），但保留性明显较差，并且有显著的分析物损失。在后续进样中，分析物和金属表面的相互作用对分离的影响逐渐减少。但是，即使色谱柱经过充分钝化（例如，6次连续柱上进样20 pmol OST），大分子寡核苷酸（dT25、dT30和dT35）的回收率仍然不理想。与此相反，5种主要寡核苷酸在ACQUITY Premier BEH Amide色谱柱上的第1次连续进样与后续进样得到一致的UV响应值，如图2B所示。此外，ACQUITY Premier BEH Amide色谱柱还能够以可重现的方式分离20种微量寡核苷酸杂质（失败序列），适用于dT3至dT24的寡核苷酸。色谱图的重现性反映了UV响应值的稳定性，说明该色谱柱无需色谱柱钝化即可实现分离。MaxPeak HPS层在金属表面和寡核苷酸之间充当屏障，避免寡核苷酸与表面发生螯合，从而显著降低相互作用。本研究表明，ACQUITY Premier BEH Amide色谱柱可实现高分离度寡核苷酸分离，无需色谱柱老化，可直接进样。

MassPREP OST标样中5种主要寡核苷酸的HILIC ESI-MS谱图见图3A。相同化合物的IP-RP ESI-MS谱图表现出不同电荷态的双峰分布³，而HILIC ESI-MS谱图的电荷明显更少，每种寡核苷酸可见3种主要的高丰度电荷态。IP-RP色谱分离依赖于带正电荷的烷基胺（溶解于高pH值流动相(pH 8–10)，以形成强离子对）和带负电荷的寡核苷酸磷酸盐骨架。这些非共价相互作用不仅对寡核苷酸分离有益且不可或缺（因为烷基胺持续与RP色谱柱的C₁₈疏水链相互作用），还会影响寡核苷酸结构，如IP-RP色谱法得到的ESI-MS寡核苷酸谱图中的双峰分布所示³。IP-RP色谱法使OST寡核苷酸部分变性，产生两种电荷态分布：一种包含低电荷态（-3至-5），对应于天然构象；另一种变性的寡核苷酸构象包含高电荷态（-7至-15）。HILIC分离不需要使用离子对试剂，寡核苷酸保留基于流动相和富水层之间的分配机制，并且部分固定于固定相上^13–14。如图3A中的ESI-MS谱图所示，HILIC相互作用似乎可保留OST的天然状态构象，其中包含数量有限的电荷态（仅3种），所有检出结果均在相对高的质量数范围内(m/z = 1000–3000)。对这些大幅精简的ESI-MS谱图（与IP-RP谱图常见的7-12电荷态谱图相对比）进行BayesSpray去卷积后得到了非常精确的完整分子量测定值，如图3B的处理结果所示。所有主要OST的质量精度均优于15 ppm，与此前在IP-RP分离中观察到的结果相同³。图3A中的HILIC ESI-MS谱图包含极高水平的钠和钾加合物离子（裸寡核苷酸信号MS响应值的20%~40%），这表明天然寡核苷酸与流动相中的痕量金属之间可能存在紧密关联。因此，HILIC LC-MS分析的灵敏度弱于变性的IP-RP LC-MS分析。

25-mer全硫代磷酸化寡核苷酸(25-mer PS oligo)是1型人体免疫缺陷病毒(HIV-1)的一种候选治疗药物^15,16，本研究通过HILIC LC-MS方法，使用与MassPREP OST混标相同的实验条件分析了该物质。相应的ESI-MS谱图见图4B，仅列出四种电荷态，再次说明该物质呈天然状态寡核苷酸构象。与此HILIC谱图截然不同，图4A中相同化合物的IP-RP谱图明显“更忙碌”，共包含11种电荷态（详细信息见参考资料[3]）。然而，在waters_connect软件中进行数据处理后得到的BayesSpray去卷积谱图表现出良好的质量精度（质量数误差为-4.0 ppm），如图4C中的屏幕截图所示。要达到这样的质量精度，必须在处理方法中选择硫代磷酸化(PS)寡核苷酸同位素模型，这些方法专为包含大量硫原子的寡核苷酸类型而设计。

IP-RP与HILIC ESI-MS谱图的电荷态差异在大分子寡核苷酸中仍然可见。通过IP-RP色谱法分析57-mer寡核苷酸可得到多种电荷态（13种）（见图5A），而通过HILIC色谱法分析仅产生3种完全不同的电荷分布（见图5B）。即使HILIC ESI-MS谱图用于去卷积的电荷态较少，但在waters_connect中进行BayesSpray处理后仍可得到与IP-RP ESI-MS谱图相似的结果：质量数误差10.2 ppm vs 13.7 ppm。两种方法的完整分子量测量的质量精度均优于15 ppm。

IP-RP vs HILIC模式除了ESI-MS谱图的电荷态差异以外，新的色谱分离技术在寡核苷酸完整分子量确认的LC-MS分析成本方面也有一定优势。假设制备相同体积的流动相，IP-RP LC-MS流动相的成本通常是HILIC流动相的10倍左右。这主要是因为LC-MS级HFIP的成本高昂，这是一种具有较强毒性的改性剂，用于增加寡核苷酸的质谱响应值。HILIC流动相不需要该改性剂，因此可以避免引入IP-RP流动相相关的毒性，使该分离模式更具吸引力。此外，使用IP-RP法分析寡核苷酸时，LC-MS信号在流动相制备后24小时开始减弱，因此需要频繁制备小体积流动相（每天200~500 mL）¹⁷。 然而，UV寡核苷酸信号的稳定性不受影响，因此对于仅使用光学检测的应用而言，不需要每天制备流动相。我们通过每天使用MS和UV检测器监测dT15寡核苷酸的峰面积，研究了HILIC方法分离寡核苷酸的ESI-MS信号稳定性。我们针对HILIC流动相的洗脱液A和B制备了两份大体积(1 L)流动相，并且在2周（14天）内每天重复进样(n=3) 10 µM OST样品。我们根据OST混合物中dT15寡核苷酸三电荷单同位素质量数（m/z = 1498.57处的[M-3H]^-3）的提取质谱图，通过峰面积监测ESI-MS信号。将此面积与相同寡核苷酸在260 nm处UV色谱图的峰面积比较，并将每次进样得到的MS vs UV峰面积相除，得到MS vs UV信号比。如图6中的峰面积比所示，2周内的响应值保持高度一致。此图清楚表明，HILIC流动相在本研究的时间周期内保持稳定，HILIC LC-MS分析相比IP-RP分析更具优势：HILIC LC-MS分析寡核苷酸无需频繁制备流动相。

• waters_connect工作流程经证明能够提供良好的质量精度（低于15 ppm），适合使用HILIC LC-MS分析进行寡核苷酸完整分子量确认
• 采用MaxPeak高性能表面的ACQUITY Premier BEH Amide色谱柱可以分析多达20种微量杂质，无需色谱柱钝化，且灵敏度和重现性均有提升
• HILIC LC-MS分析的优势主要集中在流动相组成方面：HILIC流动相与IP-RP流动相相比毒性低、成本低，LC-MS稳定性更佳。
• 本研究开发的HILIC LC-MS分析方法可视作寡核苷酸完整分子量分析的可行替代方法。
  
  

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