• 应用纪要

药丸测试应用中的毒品靶向分析

药丸测试应用中的毒品靶向分析
  • Michael Gray
  • Adam Rohde
  • Waters Corporation
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仅适用于法医毒理学应用。

摘要

我们开发出一种利用ACQUITY UPLC H-Class和CSH色谱柱技术的优势快速分析十种毒品的方法。所有十种碱性毒品（包括安非他命和3,4-亚甲二氧基甲基苯丙胺(MDMA)）均在3 min内得到色谱分离，总运行周期为6.3 min。该方法针对实验室和现场部署而开发。

与该方法相关的校准范围为0.005 mg/mL~0.1 mg/mL。制得的样品浓度为0.1 mg/mL。所有十种毒品化合物的校准曲线均表现出优异的线性，决定系数(R2)≥0.997。在预期样品浓度(0.1 mg/mL)下，分析准确度出色，所有化合物的回收率百分比均在98%~103%的范围内。

利用Empower色谱数据系统(CDS)定量分析从音乐节上获取的毒品材料。利用谱库匹配功能改善化合物鉴定可信度，利用自动峰纯度计算功能进一步提高定量可信度。最后，采用ACQUITY QDa质谱检测器，对具有相似UV谱图的化合物展示质谱检测的显著优势。

优势

  • 利用UPLC快速分离十种毒品化合物
  • 碱性毒品化合物获得优异的峰对称性
  • 简单的酸性流动相，兼容MS
  • 使用Empower CDS和峰纯度实现准确定量
  • 使用谱库匹配和质谱检测提高鉴定可信度

简介

毒品和药丸测试是一种减少危害的措施，目的是减小在音乐节及其他场合吸毒对健康产生的不利影响1。 几十年来，药丸测试已在全球一系列管辖区实施，力求更好地告知病人药物成分并提供可能改变用户行为的健康建议2,3。 在音乐节及其他场合进行药丸测试的呼声越来越高4,5。 但是，也有人担心，在节日环境中部署的药丸测试方法通常是定性方法，无法为服务病人提供毒品纯度等重要信息。

当前用于分析毒品的靶向LC-PDA分析方法通常依赖流动相添加剂，例如高pH条件下的吡咯烷，以在反相分离柱上获得合理的峰形。但是，将这类方法部署到现场存在严重的健康和安全问题。

本应用纪要介绍了一种使用ACQUITY UPLC H-Class搭配PDA和ACQUITY QDa质谱检测快速分离和定量十种毒品化合物的方法。利用表面带电杂化(CSH)色谱柱技术解决峰对称性和分离度不佳的难题，同时使用常见且简单的酸性流动相组成。由于流动相pH保持在较低水平，电喷雾效率大幅提升，从而能够有效利用ACQUITY QDa质谱检测器。质谱数据提供了额外的确证信息，能够进一步区分具有相似UV谱图的化合物，并且可靠地鉴定共洗脱物。还利用了Empower软件，自动使用峰纯度、UV谱库匹配和MS谱库匹配功能提高结果可信度。 

实验

标样制备

标准品购自澳大利亚国家计量研究院（澳大利亚北莱德）或Tasmanian Alkaloids（澳大利亚韦斯特伯里）。用97%水/3%甲醇制备浓度为1 mg/mL的单标储备液。然后合并这些单标储备液，制得浓度范围为0.005 mg/mL~0.1 mg/mL的六种混标溶液。

样品前处理

从音乐节上获取的一系列固体毒品由澳大利亚国立大学经许可提供，用于组分鉴定和纯度检测。各毒品取1 mg溶于97%水/3%甲醇中，制得最终浓度为0.1 mg/mL的样品。然后在分析前过滤(0.2 µm)样品溶液。 

分析方法

表1~4详细列出了采用的分析条件，表5总结了用于鉴定十种分析物的具体条件。

液相色谱系统：

ACQUITY UPLC H-Class PLUS

检测条件：

ACQUITY UPLC光电二极管阵列(PDA)检测器，210~400 nm，每秒20个数据点

样品瓶：

LCMS认证透明样品瓶（部件号：600000668CV）

色谱柱：

ACQUITY UPLC CSH C18, 50 × 2.1 mm, 1.7 µm（部件号：186005296）

柱温：

40 °C

样品温度：

12 °C

进样体积：

1 µL

流速：

0.5 mL/min

流动相A：

0.1%甲酸的水溶液

流动相B：

甲醇

表1.液相色谱条件
表2.梯度表

质谱系统：

ACQUITY QDa质谱检测器

电离模式：

ESI+

采集范围：

50~600 Da

毛细管电压：

1

锥孔电压：

10 V

表3.ACQUITY QDa质谱检测器设置

色谱软件：

Empower 3 CDS

质谱软件：

Empower 3 CDS

信息学软件：

Empower 3 CDS

表4.数据管理
表5.用于组分分析的PDA和ACQUITY QDa检测器信息

结果与讨论

UPLC-PDA

十种毒品的分离结果如图1所示。为方便起见，在该色谱图中标记出所有组分。如图所示，所有十种组分均在3 min内完成基线分离和洗脱。

图1.十种毒品(0.05 mg/mL)的ACQUITY UPLC H-Class-PDA分离结果，使用CSH C18色谱柱，检测波长257 nm。

本研究还评估了十种靶向毒品的校准曲线。应用了权重为1/x的线性拟合。结果见下面的表6，表现出优异的线性，所有化合物的决定系数均≥0.997。校准曲线示例见图2。 

表6.0.005、0.015、0.05和0.1 mg/mL样品四次单独分析的校准曲线决定系数、平均QC样品回收率和RSD
图2.(a)安非他命、(b) MDMA和(c)海洛因的标准曲线示例

制备四个QC标准品以评估定量分析中十种组分的回收率。但是，在各样品浓度为0.1 mg/mL的应用中，预计定量结果一般会接近上限。表6显示，0.1 mg/mL QC标准品四次单独分析的平均回收率在97.9%~103.1%的范围内，表现出良好的定量准确度。此外，这些测量的精密度优异，RSD百分比在0.6%~1.4%的范围内。更低浓度的样品也获得了可接受的准确度。

为评估所开发方法的性能，本研究考察了从音乐节上获取的11个样品。分析结果见下方表7。如上所述，称取1 mg未知样制得浓度为0.1 mg/mL的样品；0.1 mg/mL的检测结果相当于药物纯度为100%的盐酸盐；或相当于药物纯度为84%的相应游离碱。由于音乐节样品的盐形式未知，因此将MDMA的百分比含量以游离碱形式表示如下。在提交的样品中，MDMA被鉴定为七个样品的主要组分和一个样品的次要组分。其中包括样品7~10，它们代表同一来源或地点的四个单独样品，以及样品 11，这些样品均由接受紧急医疗服务的病人提供。另外3个样品由测试组之外的物质组成，利用FTIR检测方法，样品3和5被鉴定为N-乙基丁酮，样品6被鉴定为N-乙基戊酮。

表7.音乐节样品的分析结果

通过UV谱图匹配提高组分鉴定可信度，对于与目标列表中的化合物具有类似保留时间的组分，该方法可大幅减少假阳性测定结果。图3显示了一个PDA匹配图示例，展示了样品谱图与PDA谱库谱图的比较。图3所示的PDA谱库匹配结果表列出了谱图对比评估的结果。在本例中，用PDA匹配角(0.065)表示的谱图差异明显小于PDA匹配阈值(1.088)，表明样品谱图与谱库谱图在统计学上相似。

图3.Empower PDA谱库匹配结果以及样品谱图与谱库谱图的PDA匹配图。蓝色迹线表示谱库谱图，红色迹线表示样品谱图。

值得注意的是，一些组分的UV谱图几乎相同，因此在UV谱库匹配过程中需要筛选保留时间，例如安非他命和甲基苯丙胺。

本研究还采用了峰纯度来改善定量结果准确度的可信度。图4显示了样品峰的峰纯度评估示例，在整个峰宽范围内，纯度角始终低于纯度阈值。该结果表明，不存在可识别的共流出物。

图4.Empower PDA峰纯度结果表以及样品谱图与谱库谱图的峰纯度图

样品1和4的报告示例见图5。图5(a)显示在样品1中检出了MDMA，含量为0.092 mg/mL或92%（以盐酸盐计）或77%（以游离碱计）。保留时间匹配，且谱库匹配在“谱库匹配ID”列中鉴定出MDMA，匹配质量在“匹配质量”列中归类为“匹配良好”。在峰纯度分析中，MDMA峰的评估结果为光谱纯，在“峰纯度”列中无可识别的共流出物。

图5b显示了第二个示例（样品4），鉴定出的MDMA含量约0.063 mg/mL（63%，以盐酸盐计；53%，以游离碱计）。基于保留时间推测存在氯胺酮，但色谱峰与谱库不匹配，表明该组分并非氯胺酮。不同的是，这种查获的毒品含有53%的MDMA（游离碱）以及一种显著的未知组分。2.253 min处的未知组分可能与氯胺酮具有不同的UV摩尔吸光系数，并表现出无意义的定量结果。

图5.在音乐节期间对药丸中的未知样品进行测试的样品分析报告示例。(a)含有MDMA的样品；(b)含有MDMA和未知掺杂物的样品。

此类信息在药丸测试环境中具有重要意义，它为提交毒品的人提供了基于风险的信息：除主要组分MDMA以外，样品中还包含大量未知毒品。 

利用ACQUITY QDa提高鉴定可信度

在分析中纳入质谱检测可显著提高化合物鉴别力，尤其是当目标列表中包含的某些化合物具有非常相似的UV谱图时。图6举例比较了MDA、MDMA与MDEA的UV和ACQUITY QDa谱图。这些化合物的UV谱图几乎相同，但ACQUITY QDa质谱图显著不同，每种分子呈现出独特的质量数指纹图谱。质谱图的显著差异清楚提供了除保留时间和UV谱图以外的重要信息。质谱图的谱库匹配可按照与UV谱图相同的方式自动完成。

图6.(a) MDA、(b) MDMA和(c) MDEA的UV与ACQUITY QDa谱图比较

尽管并非本研究的重点，但可以肯定的是，ACQUITY QDa也可以用于定量分析，与UV检测相比可显著提高灵敏度和选择性。可能只需少量样品即可完成分析。

结论

  • 本研究证明，ACQUITY UPLC H-Class搭配PDA和ACQUITY QDa为快速定量十种靶向毒品提供了理想的解决方案。
  • UPLC运行周期为6.2 min，可实现快速分析。
  • 标准曲线表现出优异的线性，R2值≥0.997。
  • PDA和ACQUITY QDa谱图提供了额外信息，有助于提高组分鉴定可信度。
  • ACQUITY QDa使最终用户能够利用经济有效的质谱检测来区分UV谱图高度相似的组分。

参考资料

  1. https://www.health.act.gov.au/about-our-health-system/population-health/pill-testing.
  2. Moller J., Jones, A. Pill-Testing as a Harm Reduction Strategy: Time to Have the Conversation.Med.J Aust 2019; 211: 10; https://doi.org/10.5694/mja2.50385.
  3. Groves A. ‘Worth the Test?’Pragmatism, Pill Testing and Drug Policy in Australia.Harm Reduct J 2018; 15: 12; https://doi.org/10.1186/s12954-018-0216-z.
  4. https://www.coronerscourt.vic.gov.au/coroner-calls-urgent-drug-testing-services-victoria.
  5. https://coroners.nsw.gov.au/coronerscourt/download.html/documents/findings/2019/Music_Festival_Redacted_findings_in_the_joint_inquest_into_deaths_arising_at_music_festivals_.pdf.

致谢

由衷感谢澳大利亚国立大学的Malcolm McLeod副教授、Patrick Yates先生和Christopher Fitzgerald先生在本研究中提供的宝贵帮助。McLeod副教授是Pill Testing Australia的科学顾问。

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