在临床研究中利用UPLC-MS/MS对六种低浓度维生素D代谢物进行定量分析

本应用纪要展示了一种专为分析血清中的六种维生素D代谢物而开发的临床研究方法，该方法具有良好的分析灵敏度。该方法使用相对简单的样品萃取程序，样品用量仅为200 µL血清，能够定量分析5 pg/mL的1,25diOHD3，并且可以区分空白的处理血清样品与相同基质中加标1.25 pg/mL 1,25diOHD3的样品。

优势

• 利用PTAD衍生化简化蛋白沉淀和SPE样品萃取程序
• 优异的分析灵敏度，能够区分空白样品与添加1.25 pg/mL 1,25-二羟基维生素D3的处理血清样品
• 所需样品量仅为200 µL

虽然维生素D在骨代谢中的作用已得到充分确认，而最近有研究表明维生素D缺乏与多种疾病之间可能存在联系，但其在其他疾病中的作用尚不明确。液相色谱-质谱联用系统(LC-MS)可以提供所需的分析灵敏度和选择性，并且能够在单次运行中定量检测多种分析物。然而，已有描述的方法通常具有复杂的工作流程，包括蒸发步骤或流动相添加剂，这可能使该系统难以用于其他研究。

因此，我们开发出一种从人血清中萃取和分析六种维生素D代谢物的半自动化临床研究方法。该方法使用CORTECS™苯基柱和Waters™ ACQUITY™ UPLC™ I-Class系统对萃取后的样品进行色谱分离，然后使用Xevo™ TQ-XS串联四极杆质谱仪（图1）进行质谱检测。该系统提供了所需的分析灵敏度。利用Hamilton STAR液体处理机器人实现萃取工作流程的自动化和简化，使得样品从最初的样品管到最终处理结果的每一个环节均可追踪。

数据管理

MassLynx软件4.2版自带的TargetLynx XS应用管理软件

样品制备

25-羟基维生素D2 (25OHD2)、25-羟基维生素D3 (25OHD3)、C3-epi-25-羟基维生素D2 (C3-epi-25OHD2)、C3-epi-25-羟基维生素D3 (C3-epi-25OHD3)、24,25-二羟基维生素D3 (24,25diOHD3)、1,25-二羟基维生素D2 (1,25diOHD2)和1,25-二羟基维生素D3 (1,25diOHD3)认证参比溶液购自Merck Life Sciences (Gillingham, UK)。24,25-二羟基维生素D2 (24,25diOHD2)认证参比溶液以及[²H₃]-25OHD2、[²H₃]-25OHD3、[²H₃]-C3-epi-25OHD3、[²H₆]-24,25diOHD3和[²H₃]-1,25diOHD3认证的标记内标溶液购自IsoSciences (Ambler, PA)。

校准品和QC样品均使用购自Golden West Biologicals (Temecula, CA)的MSG2000处理血清在替代基质中制备，涵盖以下浓度范围（表3），QC浓度显示在括号中。

LC-MS级水和甲醇购自Honeywell (Bracknell, UK)。乙腈和甲酸购自Greyhound (Birkenhead, UK)。氟化铵和硫酸锌购自Sigma-Aldrich (Gillingham, UK)。 

样品萃取

样品萃取采用Hamilton STAR液体处理机器人。

向200 μL样品中加入20 μL内标并混合。依次加入硫酸锌水溶液和甲醇，进行蛋白沉淀，每次添加后将样品充分混合。将样品离心，随后将上清液转移到Oasis PRiME HLB µElution板（部件号：186008052）。使用甲醇/水溶液清洗样品并保持真空以使萃取吸附剂干燥。然后使用乙腈洗脱样品并使用PTAD试剂进行衍生化。在衍生化后，加入蒸馏水以淬灭反应，并将样品直接进样至UPLC-MS/MS系统。在衍生化之前无需进行蒸发，由此简化萃取工作流程。

以下所示为人血清样品中维生素D代谢物的示例色谱图（图2）。

注：补充1,25diOHD2和24,25diOHD2仅用于监测目的，以在低浓度下获得可检测的峰。

在五天内萃取并测定QC L、QC M和QC H的五个重复样品以评估精密度。所有维生素D代谢物在所有浓度下的运行内精密度和总精密度均≤ 7.2%CV，如表4所示。

在四天内萃取并定量分析使用处理血清制备的十个含低浓度维生素D代谢物的重复样品，以此评估分析灵敏度。将LLOQ确定为精密度≤ 20%CV且信噪比(S:N(ptp)) ≥ 10:1的最低浓度。维生素D代谢物的LLOQ如表5所示。对于25OHD3、C3-epi-25OHD3和25OHD2，MSG2000处理的人血清中包含的内源性物质限制了LLOQ的进一步降低。

图3显示了空白和加标1,25diOHD3的MSG2000处理人血清的低浓度样品的典型色谱图。虽然在%CV ≤ 20%且平均S:N(ptp) ≥ 10:1的条件下实现了2.5 pg/mL的LLOQ，但一些重复样品不满足信噪比要求，因此，认为1,25diOHD3的LLOQ为5.1 pg/mL。此外，可以区分空白处理血清样品与加标1.25 pg/mL 1,25diOHD3的相同血清样品。 

此方法在表3所示的范围内对所有维生素D代谢物均呈线性关系，该结果是通过将低浓度和高浓度混合样品以已知比例混合，得到上述浓度范围内的多达10个样品之后测定而得。加标处理血清样品得到的所有校准线都是线性的，测定十个不同样品中维生素D代谢物时的决定系数(r²) > 0.99。

通过分析所有维生素D代谢物的一系列空白和高浓度（校准品7的3倍）样品，对分析残留进行评估。未观察到明显残留，所有响应均小于低浓度校准品样品的20%。开发出按照样品对校准品0为1:1和1:4的比例稀释样品的方案，且已证明该方案能够提供85%~115%范围内的回收率，可以稀释超出所定量的所有维生素D的代谢物校准范围的样品。

本研究测定了典型的内源性干扰物（胆红素、胆固醇、脂肪乳剂、甘油三酯和尿酸），与对照相比得到的测试样品百分比回收率都在±15%以内。使用来自六个供体的血清样品研究基质效应。虽然在单独评估分析物峰面积时观察到离子抑制（回收率小于1.0），但这一效应已经通过内标得到补偿，如归一化基质因子结果所示。基于分析物:内标响应比率的所有归一化基质因子计算结果均在0.85～1.15的范围内（表6）。由于所得样品中存在高浓度内源性25OHD3和C3-epi-25OHD3，因此无法评估低浓度加标。

通过分析40个DEQAS样品(Charing Cross Hospital, UK)中的代谢物25OHD3和1,25diOHD3，对计算得出的浓度分别与NIST认定值或LC-MS截尾均值(LC-MS TM)进行比较，以评估准确度。针对25OHD3和1,25diOHD3评估的准确度可参见表7和图4。观察到25OHD3的结果与DEQAS NIST认定值相比一致性良好，仅有极小偏差，但是观察到1,25diOHD3的结果与DEQAS LC-MS截尾均值相比一致性良好，有负偏差。产生负偏差的原因之一可能是该代谢物可能受到其他二羟基维生素D代谢物的干扰，这些代谢物在使用该方法时发生色谱分离，如图2所示。

我们已开发出一种分析血清中的六种维生素D代谢物的临床研究方法，该方法具有良好的分析灵敏度。该方法使用相对简单的样品萃取程序，样品用量仅为200 µL血清，可以区分空白的处理血清样品与相同基质中加标1.25 pg/mL 1,25diOHD3的样品，并能够定量分析5 pg/mL的1,25diOHD3。在样品萃取时，也可以利用Hamilton STAR液体处理机器人实现半自动化，使得样品从样品管条形码到处理结果的每一个环节均可追踪。

本文介绍的分析方法表现出优异的五天内精密度、准确度以及整个测量范围内的线性。本研究所测试的内源性化合物无明显残留或干扰，基质效应已通过使用内标得到补偿，并且可以进行高达1:4的稀释。