• 应用纪要

使用更新的HPLC方法分析市售营养补充剂中的氨基酸

使用更新的HPLC方法分析市售营养补充剂中的氨基酸
  • Kimberly Martin
  • Paula Hong
  • Jennifer Simeone
  • Waters Corporation
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摘要

随着市售营养补充剂越来越受欢迎，监测这些产品中的氨基酸含量以确保产品的安全性和有效性变得尤为重要。然而，这些产品受到不同国家监管机构的管控，其安全要求也各不相同1,2。 尽管营养补充剂中氨基酸的药用属性尚不明确，但这些营养补充剂的标签说明被假定为准确无误。为了验证标签声称的准确性，我们使用更新的HPLC方法评估了两种天然营养补充剂样品4。

优势

  • 能够定量膳食营养补充剂样品中的氨基酸
  • 与传统HPLC方法相比，使用AccQ•Tag Ultra™ C18 2.5 µm色谱柱能够缩短运行时间，从而提高通量并减少溶剂消耗

简介

通过柱前衍生化方法常规分析氨基酸的应用非常广泛。近年来，由于膳食营养补充剂的广泛销售和应用，氨基酸分析也变得越来越普遍。出于多种原因，膳食营养补充剂的分析可能非常棘手，首先，它们可能有多种不同形式，且每种形式都具有不同的溶解度。最后，调味剂和其他稳定剂可能会也可能不会衍生化，而这会影响氨基酸分析。为了定量这些营养补充剂中的氨基酸，柱前衍生化方法通常很有用，它可以尽量减少制剂中可能影响定量的其他组分的干扰。本研究中使用的柱前衍生化试剂是6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯（AQC试剂）。反应在80%的水相环境中进行，尽可能地减少了样品基质中盐和其他化合物的干扰。

为了获得准确可靠的结果，采用良好的方法来定量营养补充剂样品中的氨基酸至关重要。本研究展示的方法可以可靠地定量分析从粉末状饮料混合物到片剂的各种营养补充剂样品中的氨基酸。

实验

所有标准曲线标准品均由Waters™氨基酸标准品（P/N：WAT088122）和Waters™细胞培养标准品试剂盒（P/N：186009300）制得，使用正缬氨酸（P/N：186009301）作为内标，0.1 N HCl作为稀释剂3。 用0.1 N HCl制备浓度为2500 µM的内标储备液。标准曲线样品的最终浓度根据各种营养补充剂的含量范围进行了调整，使用的正缬氨酸（内标）浓度为250 µM。

氨基酸营养补充剂样品前处理

购买的样品包括1片氨基酸营养补充片剂（样品1）和1份氨基酸营养补充混合饮料粉（样品2）。

按照以下步骤进行样品前处理：

研钵和研杵研磨样品1（氨基酸营养补充片剂），然后用10 mL 0.1 N的盐酸水溶液进行稀释。然后将样品1置于振荡器中，震荡30分钟，然后在2000 rpm下离心10分钟。随后将上清液转移至干净的离心管中，并用0.1 N的盐酸水溶液按1:10的比例进行稀释。

样品2（混合饮料粉）使用0.1 N HCl水溶液根据每勺（重7.160 g）的推荐液体量进行复溶。将样品搅拌30分钟，然后在2000 rpm下离心10分钟。然后，将上清液转移至干净的离心管中，并用0.1 N的盐酸水溶液按1:100的比例进行稀释。

然后使用Waters AccQ•Tag Ultra衍生化方案对两种样品进行衍生化处理。

液相色谱条件

液相色谱系统：

配备CH-A柱温箱的ACQUITY Arc™系统

检测：

配备低扩散型10 mm UHPLC流通池的ACQUITY Arc™ - 2489 UV检测器（P/N：176017007）

波长：

260 nm

采集速率：

10 Hz

样品瓶：

LCGC认证透明玻璃12 × 32 mm螺纹颈口全回收样品瓶，带瓶盖和PTFE/硅胶隔垫（无预开口）（P/N：186000384C）

色谱柱：

AccQ•Tag™ Ultra C18色谱柱, 2.5 µm, 4.6 × 150 mm（P/N：186010407）

用于水解产物和细胞培养标准品的柱温：

43 °C

样品温度：

20 °C

进样体积：

2 µL

流速：

1.5 mL/min

流动相A：

AccQ•Tag™ Ultra洗脱液A（P/N：186003838）

流动相B：

90:10 (v/v)水:AccQ•Tag Ultra洗脱液B

流动相C：

Milli-Q水

流动相D：

AccQ•Tag™ Ultra洗脱液B（P/N：186003839）

样品管理器清洗液：

95:5 (v/v)水:乙腈

样品管理器清除液：

95:5 (v/v)水:乙腈

梯度表

数据管理

色谱数据系统：

Empower 3，FR 3.6.1

结果与讨论

研究中购买并分析了几种能量营养补充剂，以定量其氨基酸含量。使用6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯(AQC)进行柱前衍生化，然后使用配备UV或荧光检测的HPLC或UHPLC系统，通过反相液相色谱分析样品。将结果与产品的标签声称进行了比较。

分析食品和营养补充剂中的氨基酸对于确保产品安全性以及产品标签声称的准确性至关重要。细胞培养标准品中所含氨基酸的分离结果如图1所示。

图1.细胞培养标准品色谱图。

氨基酸营养补充剂样品结果

营养补充片剂（样品1）的总氨基酸含量等于每5片含5000 mg氨基酸，相当于每片1000 mg。通过分析单片来测定氨基酸含量。根据每次进样获得的氨基酸重量计算了每个样品的氨基酸含量。总值是由重量累加而得，因此对于样品稀释进行了计算调整。测得氨基酸含量为每片1.008 g，与标签声称相比，差异<1%（表1）。

混合饮料粉（样品2）获得了单个氨基酸的含量。标签声称报告的氨基酸含量基于粉末重量和溶解水体积。结果最终被换算为每种氨基酸的重量和样品的总氨基酸重量（基于总稀释量）。鉴定所列出的氨基酸后，所得含量与标签声称的对比如表2所示。

将结果与产品标签声称进行比较，其中包括一种混合饮料粉营养补充剂和一种氨基酸营养补充片剂。结果表明，该方法能够定量多种能量营养补充剂中的氨基酸含量。

图2.氨基酸营养补充剂样品1和样品2的色谱图。
表1.氨基酸营养补充剂样品1的定量结果vs.标签声称(g)。

所有样品均使用Waters AccQ•Tag Ultra衍生试剂盒进行分析，该试剂盒能够尽可能地减少样品中的干扰，从而实现准确的定量。样品1单片剂中的氨基酸总重量与标签声称差值在1%以内。

表2.氨基酸营养补充剂样品2的定量结果vs.标签声称(g)。

样品2的氨基酸总重量与标签声称的差值在2.2%以内，各氨基酸含量与标签声称的差值在4.5%以内。

结论

分析食品和营养补充剂中的氨基酸对于确保产品安全性以及产品标签声称的准确性至关重要。膳食营养补充剂的定量分析结果表明，氨基酸含量与营养补充剂样品的标签声称相比具有良好的一致性，差值在4.5%的范围内，证明了该方法的准确性。结果表明，该方法能够定量多种能量营养补充剂中的氨基酸含量。

参考资料

  1. Miro Smirga.International Regulations on Amino Acid Use in Foods and Supplement and Recommendations to Control Their Safety Based on Purity and Quality, Journal of Nutrition. 150:2602S-2605S. 2020.
  2. Ashley Roberts.The Safety and Regulatory Process for Amino Acids in Europe and the United States. Journal of Nutrition.146(Suppl):2635S-2642S, 2016.
  3. 《氨基酸标准品试剂盒维护和使用手册》.沃特世维护和使用手册. 72000663ZH.
  4. Kimberly Martin, Kenneth D. Berthelette, Paula Hong.使用AccQ•Tag™ Ultra C18 2.5 µm色谱柱进行可靠的氨基酸分析的仪器注意事项.沃特世应用纪要. 720007678ZH. 2022.
  5. Paula Hong, Donna Johnson, Donald A. Trinite, Bill Warren, and Ning Zhang.氨基酸水解和分析综合指南.沃特世公司.2019.

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