使用Xevo™ G3 QTof、BioAccord™ LC-MS系统和waters_connect™信息学软件进行生物治疗性蛋白质表征和属性监测

随着生物类似药单克隆抗体(mAb)药品的日益普遍，使用有效的工具来正确评估其分析可比性就显得尤为重要。这些工具应能够执行详细的肽水平分析，包括在肽图表征研究（属性定义）过程中定位翻译后修饰(PTM)，以及在开发和商业化阶段监测样品中关键产品的相对丰度和工艺属性。符合法规要求的waters_connect信息学平台提供了基于应用程序的高效自动化工作流程，从采集到分析再到报告均适用。本研究采用waters_connect UNIFI™应用程序中的肽图分析工作流程，利用ACQUITY™ Premier UPLC™系统与Xevo G3 QTof质谱仪联用进行表征。处理肽图分析数据后，将选定的属性肽添加到科学库中的自定义数据库中，然后导入Peptide MAM应用程序，用于靶向分析。Peptide MAM应用程序用于在BioAccord LC-ToF质谱检测系统上监测生物类似药样品和降解条件下的属性。结果展示了用于属性表征和监测的简化集成工作流程，适用于多个LC-HRMS仪器平台。

优势

• 使用Xevo G3 QTof对原研药和生物类似药mAb进行高可信度的肽图分析，包括修饰定位
• 通过联网的waters_connect信息学平台，实现仪器间方法的无缝转换
• 使用BioAccord系统对肽类进行MAM分析的高效、合规工作流程，支持监测目标属性和基于“新峰”检测的纯度评估
  

在单克隆抗体(mAb)药品上市之前，必须仔细评估其关键质量属性(CQA)，确保生产过程能够保持产品的安全性和有效性。该过程包括使用肽图分析对蛋白质进行表征，这要求mAb具有高序列覆盖率并能够定位任何修饰，以便鉴定潜在的CQA，并随着产品开发和商业化的进程，监测样品的这些属性。通过分析CQA的丰度变化，我们可以深入了解与产品有效性、安全性和工艺稳定性相关的因素。正确评估CQA对于新产品的上市至关重要，同样，对于生物仿制药品而言也极为重要，尽管它们具有相同的序列，但由于生产过程的差异，某些属性的水平可能会有所改变。生物相似性的确定涉及生物类似药产品与原研药参比物质的属性比较，以及压力和强制降解行为下的可比性分析。过去，这个过程需要采用多种正交分析技术来评估各项属性，并进行优化。然而，现在越来越多的人采用多属性方法(MAM)，通过单一LC-MS分析方法定量分析多个样品的多项目标属性。

虽然用于蛋白质表征的肽图通常需要具有MSMS功能的高分辨率质谱仪，以确保属性的准确鉴定，但可以使用更简单的质量分析器进行上述属性监测，这种分析器尺寸更小、成本更低，并且易于操作，适合非质谱专家使用。集成的waters_connect信息学平台支持在合规环境中，进行LC-MS仪器之间的无缝方法转换（图1）。本研究展示了如何在最新一代Xevo G3 QTof质谱检测器上的waters_connect信息学平台内执行肽图分析和工作流程监测。本研究进行了四种英夫利昔单抗样品（原研药Remicade™，以及生物类似药Inflectra™、Avsola™和Renflexis™）的肽图分析，包括脱酰胺、氧化、赖氨酸剪切和糖基化修饰等属性分析。使用waters_connect中集成的UNIFI应用程序在Xevo G3 QTof仪器上对胰蛋白酶酶解的mAb样品进行肽表征，以便鉴定和定位翻译后修饰(PTM)。使用集成Peptide MAM应用程序的BioAccord LC-MS系统监测属性²。 在热降解研究中，可重现地监测不同生物类似药在不同时间点上的属性。

样品描述

英夫利昔单抗样品经受了在37℃下零（无热降解）、1或2周热降解，然后进行还原、烷基化、脱盐、胰蛋白酶酶解和酸化（用0.1%甲酸），并稀释至最终浓度0.2 µg/ µL。

数据管理

使用搭载集成的UNIFI应用程序（3.1.0.16版）和Peptide MAM应用程序（1.5.0.13版）的waters_connect信息学平台（2.2.0版）采集并处理数据。

在mAb生物类似药产品可以放行之前，必须鉴定CQA并与原研药相比进行相对定量。此前，我们已经展示了如何在Xevo G3 QTof质谱仪上完成该工作流程³。 本文将介绍如何将工作流程转移至QC适用的BioAccord LC-MS系统，以便在Xevo G3 QTof上完成表征工作后进行属性监测（图1）。

将ACQUITY Premier UPLC系统与Xevo G3 QTof质谱仪联用，分析各种mAb的胰蛋白酶酶解样品。利用MS^E（数据非依赖型采集）鉴定肽，包括低水平的修饰肽。使用waters_connect UNIFI应用程序采集数据，并使用集成的肽图分析工作流程进行处理。根据精确质量数（在5 ppm以内）和高能量数据通道中的碎片离子（b/y离子≥3），每个英夫利昔单抗样品表征的序列覆盖率均大于95%。此外，研究中还鉴定出了6种氧化PTM、12种脱酰胺PTM和28种糖基化修饰PTM。图2展示了两种肽（重链胰蛋白酶肽(HT)-02和HT-11）在未修饰和氧化形式下的高能量质谱仪MS^E谱图。每个肽的氨基酸骨架上都提供了高覆盖率的匹配碎片离子，既能可靠地鉴定肽分配结果，又能将修饰定位到肽序列内的不同氨基酸。谱图是采用数据非依赖型采集方式获得的，因此方法开发在得到简化的同时仍可确保高质量的分配。

为了确定每种生物类似药的分析可比性，在waters_connect信息学平台（包括简化的数据采集、处理和报告）内的MAM工作流程中可以选择要监测的属性。为靶向监测选择的每种肽（包括修饰形式和未修饰形式）都可以添加到自定义科学库中。waters_connect中的科学库作为储存库，用于保存可供后续靶向分析使用的组分信息，包括质量数、电荷、保留时间等多种属性的信息。用户无需手动输入数据，即可为每个分子创建科学库，同时保持数据的可追溯性。选择要监测的属性后，可以从科学库中将它们导入Peptide MAM应用程序的分析方法中进行监测。表1列出了本研究中选择监测的属性列表。 

使用BioAccord LC-MS系统对不同样品组的属性进行监测，该系统是一个适用于TOF的HRMS平台，非常易于使用，可针对属性分析生成稳定且高质量的结果。本研究使用了在Xevo G3 QTof MS上鉴定的属性子集。这些属性在英夫利昔单抗生物类似药产品样品和在降解研究中暴露于强制降解条件下的样品中进行了监测。系统适应性进样与样品进样交错进行，以确保系统产生的结果符合既定的性能规格范围。利用MassPREP™肽混标（P/N：186002337）进行系统适用性进样。这些进样会在Peptide MAM应用程序的样品列表中被标记，并根据指定的标准进行评估，包括质量误差、保留时间误差、响应和峰宽。在Peptide MAM应用程序处理结果之后，可以单独查看系统适应性进样，如图3A所示。肽的测定结果可以在每张色谱图中查看，或者作为所有系统适应性进样的趋势查看，这样既能评估每次进样的通过/失败标准，又能识别样品序列分析过程中的系统性漂移。

监测整个样品序列的属性时，将所有样品进样的保留时间与指定的参比进样进行对齐比较，确保适当的峰得到同时检测。图3B展示了长序列末端进样的保留时间对齐示例。上方的叠加色谱图（蓝色为参比物质，橙色为当前样品）展示了对齐前的情况，下图为对齐后的情况。虽然得益于UPLC系统的稳定性能，在对齐前的色谱图匹配程度已经非常好了，但在保留时间对齐后，所有进样的色谱图能够近乎完全重叠。在查看保留时间对齐结果后，监测属性的相对定量结果可以按样品或属性以条形图形式查看，如图3C所示，从而实现对数据的快速评估。单击View Injection（查看进样）选项卡，可以仔细检查数据中的各个属性，显示的信息如图3D所示。您可以在色谱图和质谱图中查看各种肽形式对应的峰。

使用Peptide MAM应用程序生成四种英夫利昔单抗产品中C端赖氨酸剪切和糖基化修饰的相对定量结果。图4汇总了三种生物类似药（Inflectra、Avsola和Renflexis）与原研药Remicade的比较结果。每个样品三次进样的平均相对标准偏差均低于4%。这种重现性能够确定所监测肽形式的相对水平差异。Remicade、Inflectra和Avsola的C端赖氨酸丰度相似，均为80%~90%，而在Renflexis中的丰度则明显较低，低于20%。这项测定很重要，因为赖氨酸剪切是生物生产过程中的常见修饰，可能会影响受体结合⁴。

样品之间的HT-26肽各种N-糖型丰度也有所不同。这些产品来源于不同的细胞系（Remicade和Inflectra来自小鼠细胞系，Avsola和Renflexis来自中国仓鼠卵巢细胞系），因此预计会有糖基化修饰差异，但定量这些差异非常重要，因为它们可能会影响药物产品的免疫原性、PK以及受体的相互作用。G0F是所有四个样品中最主要的糖型，它在Avsola中的丰度最高，为73%，而在Inflectra中丰度最低，为54%。第二主要的糖型为G1F，其占比约为20%~40%。其他不太主要的糖型为G2F、G0F-GlcNAc和G1F-GlcNAc，在不同样品间也存在差异。其中最值得注意的是，G1F-GlcNAc在Remicade中约为2%，而在三种生物类似药中约为0.3%。

为了进一步研究样品差异，对原研药和一种生物类似药Inflectra进行了强制降解研究。在加速降解研究中，药物在等同于或超过其预期上限的条件下处理，这有助于评估药物的有效期和稳定性⁵。 实验中，样品在37 °C下进行热降解处理，持续1周和2周，然后对几种肽的氧化或脱酰胺程度进行了定量分析。结果汇总于图5中，其中蓝色表示Remicade，橙色表示Inflectra，颜色越深表示降解持续时间越长。总体来说，两种样品中每种肽的脱酰胺百分比相符，并且随着热诱导降解持续时间的增加而增加。尽管观察到差异，但肽的氧化在两种样品中均无明显趋势。预计生物类似药在降解条件下不会表现出相同的响应，但预计它们将通过类似的途径降解。但是，观察到的任何差异都需要进行风险评估，以确定对药品安全性和适当处理的潜在影响。

除了重要和关键属性的相对定量外，在兼容性评估中监测生物类似药样品中有显著倍数变化的“新峰”通常也很重要。新峰检测是用作产品纯度测试的肽MAM工作流程中的关键组成部分，因为该工作流程可以识别质谱仪数据通道中的全新或变化的特征，即那些在参比样品中不存在并且未包含在目标属性列表中的“峰”。最近的一篇应用纪要中详细介绍了MAM应用程序中NPD（新峰检测）的工作原理⁶。此步骤适用于杂质分析或快速评估降解样品中的差异。新峰检测功能使用图6所示的标准，在降解样品中检测到40个“新峰”。这些峰的特征汇总于左图中。单击Review（查看）链接将打开新峰的数据查看窗口，可以进一步检查每个峰。在这里，用户确定的每个假阳性峰都可以选择拒绝，或者如果确定某个峰是一个需要进一步调查的新峰，则可以将它标记为已确认。如果MS^E高能量数据通道的碎片离子数据显示有足够多的特征b/y离子可用于确认分配，则之后可通过UNIFI应用程序肽图分析工作流程从同一数据集中快速鉴定已确认的新峰，或者使用靶向肽MSMS进行后续研究。图6中的示例在肽图分析数据处理中被鉴定为HT 9-10肽段漏切，这可能是样品前处理带来的干扰因素，而不是与降解相关的杂质。无论如何，所有新峰随后都可以根据需要标记，以便进一步研究。

尽管生物类似药mAb的一级序列与原研药相同，但生产工艺的差异通常会导致药品属性特征的差异。在评估生物相似性时，必须确定分析比较研究中观察到的这些差异不具有临床相关性。因此，对产品属性的表征和监测是将生物类似药产品推向市场的一个重要步骤。本研究展示了waters_connect信息学平台如何支持这一合规性MAM工作流程，即使是在运行的不同仪器系统之间，此工作流程也可以在waters_connect信息学平台下进行。Xevo G3 QTof质谱仪实现了高序列覆盖率和PTM定位，然后可以从结果表中选出可能的CQA监测点。该列表随后可用于肽MAM监测方法，支持对大型样品组进行相对靶向定量和新峰检测。该工作流程已部署用于生物类似药产品与参比原研药的比较，以及这些分子的降解研究。借助waters_connect平台的自定义科学库功能，两种肽分析工作流程可以无缝整合，进而有效地将表征分析获得的信息转换为能够轻松部署到负责分析实验室中的监测功能。

1. Rogers RS, Nightlinger NS, Livingston B, Campbell P, Bailey R, Balland A. Development of a Quantitative Mass Spectrometry Multi-Attribute Method for Characterization, Quality Control Testing, and Disposition of Biologics.mAbs.2015 Aug, 7(5), 881-890.
2. Ranbaduge N, Yu YQ.以精简、合规的工作流程执行肽段多属性方法(MAM).沃特世应用纪要.720007094ZH, 2020年12月.
3. DeLaney K, Ippoliti S, Reid L, Cornwell O, Yu YQ, Harry E, Towers M. 在Xevo™ G3 QTof平台上应用肽图分析和多属性方法(MAM)工作流程执行mAb药品的生物类似药比较.沃特世应用纪要, 720007632ZH, 2022年5月.
4. Faid V, Leblanc Y, Berger M, Seifert A, Bihoreau N, Chevreux G. C-terminal Lysine Clipping of IgG1: Impact on Binding to Human FcγRIIIa and Neonatal Fc Receptors.Eur J Pharm Sci.2021 Jan, 159, 105730.
5. Pisupati K, Benet A, Yian Y, Okbazghi S, Kang J, Ford M, Saveliev S, Sen KI, Carlson E, Tolbert TJ, Ruotolo BT, Schwendeman SP, Schwendeman A. Biosimilarity Under Stress: A Forced Degradation Study of Remicade® and Remsima™.mAbs.2017 Aug, 9(7), 1197-1209.
6. Ranbaduge N, Yu YQ.利用简化工作流程扩展BioAccord LC-MS系统功能用于合规的多属性方法(MAM).沃特世应用纪要, 720006963ZH, 2020年7月.